本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种PK细胞低血清培养基及其制备方法。
背景技术：
：PK(猪肾)细胞低血清培养基是指需要添加少量血清就可以维持细胞在体外长时间生长和繁殖的合成培养基，由多种氨基酸、维生素、微量元素、植物蛋白水解物以及无机化合物组成，为PK细胞提供最优化的生长环境。PK细胞低血清培养基生产属于生物医药行业的基础产品。随着生物制药和生物医疗行业技术的更新换代，细胞培养技术也在不对进化，血清用量逐渐减少，生产企业需要不断创新技术，开发高质量PK细胞低血清细胞培养基产品满足下游客户需求。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种PK细胞低血清培养基，本发明培养基成分简单、相对成本较低、质量稳定，并且该培养基的制备方法操作简单，易于控制，各个组分在培养基中分散均匀，各批次培养基之间的差异较小。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：一种PK细胞低血清培养基，按照重量份数计，包括：进一步优选地，按照重量份数计，所述氨基酸或其盐包括：进一步优选地，所述无机盐包括：进一步优选地，按照重量份数计，所述维生素包括：进一步优选地，所述植物蛋白水解物包括以下中的一种或几种：大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土豆蛋白水解物、豌豆蛋白水解物。进一步优选地，按照重量份数计，所述微量元素包括：进一步优选地，一种PK细胞低血清培养基的制备方法，包括以下步骤：步骤一、按照配方中各组分的重量份数配比，将氨基酸或其盐与碳水化合物D-葡萄糖混合均匀，干燥，制得第一组分；步骤二、按照配方中各组分的重量份数配比，将无机盐各成分混合均匀，干燥，制得第二组分；步骤三、将维生素、谷胱甘肽、氢化可的松、次黄嘌呤、亚油酸、胰岛素配制成溶液，在溶液中加入赋形剂，干燥，制得第三组分，赋形剂在第三组分中的含量为85～95％；步骤四、将微量元素中各组分配置成溶液后，在溶液中加入赋形剂，干燥，制得第四组分，赋形剂在第四组分中的含量为85～95％；步骤五、将所述第一组分、第二组分、第三组分和第四组分混合后，加入植物蛋白水解物球磨，制得PK细胞低血清培养基。进一步优选地，步骤一中的干燥在70～90℃的温度下进行，并且干燥时间为2～3小时；步骤二中的干燥在105～120℃的温度下进行，并且干燥时间为3～5小时；步骤三和步骤四中的干燥均为真空冷冻干燥。进一步优选地，步骤五中控制球磨时间为2-4小时，并使PK细胞低血清培养基的平均粒度不小于120目。进一步优选地，将制备的PK细胞低血清培养基配制成培养液，对PK细胞进行培养，其中，控制培养液中PK细胞低血清培养基的质量含量为1～3％。进一步优选地，所述赋形剂可为本领域常规的赋形剂，例如甘露醇、氯化钾、葡萄糖、组氨酸、甘氨酸等。在本发明的步骤三中，可以根据第三组分中各成分的溶解性质而采用水、酸溶液、碱溶液中的一种进行溶解，各成分可以单独进行溶解，也可以使溶解性质相同的成分按照重量份同时溶解于水、酸溶液、碱溶液中的一种中，在混合形成的第一混合溶液中，各成分的重量份应当满足第三组分中各成分的重量份配比要求，并且第三组分中各成分在第一混合溶液的总质量含量可以为5～15％。在本发明的步骤四中，可以根据第四组分中各成分的溶解性质而采用水、酸溶液、碱溶液中的一种进行溶解，并且在混合形成的第二混合溶液中，各成分的重量份应当满足第四组分中各成分的重量份配比要求，并且第四组分中各成分在第二混合溶液的总质量含量可以为5～15％。具体地，溶解各成分所采用的水可为超纯水；酸溶液的质量浓度可以为5％-30％，并且酸溶液所采用的酸的类型可选自盐酸、硫酸和硝酸中的一种；碱溶液的质量浓度可以为10％-50％，并且碱溶液所采用的碱的类型可选自氢氧化钠和氢氧化钾中的一种。进一步优选地，在制备第三组分和第四组分时，可按照扩大的重量份进行制备，以使各成分在培养基中分散更加均匀；并且，在制备第三组分和第四组分后，可按照重量份要求与第一组分和第二组分进行混合，并使最终制得的动物细胞培养基中各成分的重量份满足上述重量份要求。本发明还提供上述任一所述的PK细胞低血清培养基在动物细胞培养上的应用。该PK细胞低血清培养基在用于PK细胞培养时，需添加少量血清、即可使PK细胞生长良好且稳定。本发明还提供一种PK细胞低血清培养方法，将上述任一所述的PK细胞低血清培养基制成培养液后，对PK细胞进行培养，其中，控制所述培养液中PK细胞低血清培养基的质量含量为1～3％，例如2％。并且，在对PK细胞进行培养时，PK细胞的接种密度可以为常规密度，例如1×105个细胞/cm2。进一步优选地，将上述任一所述的PK细胞低血清培养基制成培养液，包括：将上述任一所述的PK细胞低血清培养基溶于水后，加入碳酸氢钠，搅拌混匀，制得培养液；其中，可以控制所述培养液中碳酸氢钠的质量含量为2～3％。制得的培养液的pH值为6.8～7.4。进一步地，所培养的动物细胞包括但不限于PK细胞。本发明的有益效果是:1、本发明的PK细胞低血清培养基不含动物蛋白，其组成简单并且明确，各成分均可通过普通市售而容易地获得，从而有利于在动物细胞培养中的实际应用。2、本发明的PK细胞低血清培养基的制备方法操作简单、易于控制，采用各组分分别进行配制的方式不仅有利于保证各成分不受到破坏，而且有利于保证各成分在培养基中的均匀分散，制备的各批次培养基之间差异小，产品质量稳定。3、本发明的PK细胞低血清培养基在应用时针对性强，用于PK细胞培养，并且培养的细胞生长状态良好且稳定，目标产品产量高，可达到常规含血清培养基的培养水平；此外，该PK细胞低血清培养基在应用时不对目标产品的分离纯化以及分析检测造成影响，应用前景广泛。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。各实施例所采用的原料的质量要求及来源为：各氨基酸或其盐、D-葡萄糖：药用级，纯度≥99％，购自sigma；各无机盐：注射级，纯度≥99％，购自sigma；各维生素：药用级，纯度≥99％，购自sigma；各微量元素：试剂级，纯度≥98％，购自国药集团；蛋白组分中的各成分：购自Kerry公司；胆碱、激素：试剂级，纯度≥98％，购自国药集团药业股份有限公司；PK细胞：来自中国药品生物制品检定所(简称中检所)。实施例1实施例1中公开了一种PK细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由3.5重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土豆蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中的一种或多种组成。其中：第一组分由如表1中的成分组成：表1实施例1中第一组分表第二组分包括如表2中所示。表2实施例1中第二组分表组分含量(重量份)氯化钠170无水磷酸二氢钠12.3无水氯化钙3四水合硝酸钙1.5五水合硫酸铜0.00009氯化钾30六水合氯化镁1无水硫酸镁1.9无水磷酸氢二钠11.2七水合硫酸锌0.008七水硫酸亚铁0.008第三组分包括如表3中所示。表3实施例1中的第三组分表第四组分包括如表4中所示。表4实施例1中第四组分表上述PK细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：1、制备第一组分按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为80℃，干燥时间为2.5小时，制得第一组分。2、制备第二组分按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为110℃，干燥时间为4小时，制得第二组分。3、制备第三组分将第三组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸钙、亚硒酸钠、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醛和盐酸吡哆醇溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第一溶液；将第三组分中的胰岛素溶于浓度为10％的盐酸溶液中，搅拌混匀，制得第二溶液；将第三组分中的其余成分溶于浓度为20％的氢氧化钠溶液中，搅拌混匀，制得第三溶液；分别将第一溶液、第二溶液和第三溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂)，其中控制第三组分中各成分在第一混合溶液中的总质量含量为10％，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第三组分。4、制备第四组分将第四组分中的二氧化锗溶于浓度为15％的氢氧化钠容这种，搅拌混匀，制得第四溶液；将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第五溶液；分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为10％，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第四组分。5、制备PK细胞低血清培养基按照上述重量份将第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物蛋白水解物混合均匀后，采用球磨机球磨3小时左右，制得平均粒度为120目以上的PK细胞低血清培养基。实施例2实施例2中公开了一种PK细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由2.3重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土豆蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中的一种或多种组成。其中：第一组分由如表5中的成分组成：表5实施例2中第一组分表第二组分包括如表6中所示。表6实施例2中第二组分表组分含量(重量份)氯化钠112无水磷酸二氢钠5.8无水氯化钙2.5四水合硝酸钙1.4五水合硫酸铜0.00008氯化钾21.5六水合氯化镁2无水硫酸镁1.3无水磷酸氢二钠4.4七水合硫酸锌0.010七水硫酸亚铁0.010第三组分包括如表7中所示。表7实施例2中的第三组分表第四组分包括如表8中所示。表8实施例2中第四组分表上述PK细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：1、制备第一组分按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为70℃，干燥时间为3小时，制得第一组分。2、制备第二组分按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为105℃，干燥时间为5小时，制得第二组分。3、制备第三组分将第三组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸钙、亚硒酸钠、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醛和盐酸吡哆醇溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第一溶液；将第三组分中的胰岛素溶于浓度为5％的盐酸溶液中，搅拌混匀，制得第二溶液；将第三组分中的其余成分溶于浓度为10％的氢氧化钠溶液中，搅拌混匀，制得第三溶液；分别将第一溶液、第二溶液和第三溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂)，其中控制第三组分中各成分在第一混合溶液中的总质量含量为5％，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第三组分。4、制备第四组分将第四组分中的二氧化锗溶于浓度为10％的氢氧化钠容这种，搅拌混匀，制得第四溶液；将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第五溶液；分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为5％，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第四组分。5、制备PK细胞低血清培养基按照上述重量份将第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物蛋白水解物混合均匀后，采用球磨机球磨2小时左右，制得平均粒度为120目以上的PK细胞低血清培养基。实施例3实施例3中公开了一种PK细胞低血清培养基，由第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物水解蛋白组成，其中植物水解蛋白由4.5重量份的大豆蛋白水解物、小麦蛋白水解物、土豆蛋白水解物和豌豆蛋白水解物中的一种或多种组成。其中：第一组分由如表9中的成分组成：表9实施例3中第一组分表第二组分包括如表10中所示。表10实施例3中第二组分表组分含量(重量份)氯化钠203无水磷酸二氢钠15.4无水氯化钙4四水合硝酸钙3.3五水合硫酸铜0.00012氯化钾44六水合氯化镁3无水硫酸镁3.9无水磷酸氢二钠13.2七水合硫酸锌0.012七水硫酸亚铁0.012第三组分包括如表11中所示。表11实施例3中的第三组分表第四组分包括如表12中所示。表12实施例3中第四组分表上述PK细胞低血清培养基可通过如下方法制备得到：1、制备第一组分按照上述重量份配比分别称取第一组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为90℃，干燥时间为2小时，制得第一组分。2、制备第二组分按照上述重量份配比分别称取第二组分中的各成分，将各成分混合均匀后，置于电热鼓风干燥箱中进行干燥，控制干燥温度为120℃，干燥时间为3小时，制得第二组分。3、制备第三组分将第三组分中的氯化胆碱、肌醇、D-泛酸钙、亚硒酸钠、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醛和盐酸吡哆醇溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第一溶液；将第三组分中的胰岛素溶于浓度为30％的盐酸溶液中，搅拌混匀，制得第二溶液；将第三组分中的其余成分溶于浓度为50％的氢氧化钠溶液中，搅拌混匀，制得第三溶液；分别将第一溶液、第二溶液和第三溶液按照上述重量份配比混合形成第一混合溶液，向第一混合溶液中加入甘露醇(赋形剂)，其中控制第三组分中各成分在第一混合溶液中的总质量含量为15％，甘露醇在第一混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第三组分。4、制备第四组分将第四组分中的二氧化锗溶于浓度为50％的氢氧化钠容这种，搅拌混匀，制得第四溶液；将第四组分中的其余成分溶于超纯水中，搅拌混匀，制得第五溶液；分别将第四溶液、第五溶液按照上述重量份配比混合形成第二混合溶液，向第二混合溶液中加入甘露醇，其中控制第四组分中各成分在第二混合溶液中的总质量含量为15％，甘露醇在第二混合溶液中的质量含量为90％，搅拌混匀后，采用冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，制得第四组分。5、制备PK细胞低血清培养基按照上述重量份将第一组分、第二组分、第三组分、第四组分和植物蛋白水解物混合均匀后，采用球磨机球磨4小时左右，制得平均粒度为120目以上的PK细胞低血清培养基。实施例4采用实施例1的方法制备三批实施例1的PK细胞低血清培养基，分别记为培养基1～培养基3。分别将2g各培养基溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀后，分别加入2％血清，制得各培养液；将培养基1～培养基3制成的培养液分别记作低血清培养液1～低血清培养液3。同时，分别将2g国内I公司PK细胞培养基、国内G公司PK细胞培养基溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入10％血清，制得各培养液；将I公司PK细胞培养基制得含血清培养液记作含血清培养液1，将G公司PK细胞培养基制得含血清培养液记作含血清培养液2。在无菌条件下，用已灭菌移液器分别将50ml的低血清培养液1～低血清培养液3及含血清培养液1～含血清培养液2转移到T75细胞培养瓶中，向各细胞培养瓶分别接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/cm2，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后，在显微镜下观察细胞，显微结果表明：低血清培养液1～低血清培养液3培养的PK细胞均形态饱满，轮廓清晰，生长状态良好。使用胰酶消化制成细胞悬液，采用贝克曼细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力(细胞活力为总细胞中活细胞所占的百分比)，结果见表13。表13各培养液培养后的细胞计数及细胞活力结果由表13可知：制备的PK细胞低血清培养基能够较好地培养PK细胞，细胞生长状态良好，细胞增殖倍数高，并且可达到常规含血清培养基的培养水平。制备的各批次PK细胞低血清培养基在对PK细胞进行培养时的培养稳定性良好，所培养的细胞数差异较小，说明本发明的动物细胞培养基质量稳定。对照例1以仅由实施例1中第一组分、第二组分、第三组分和植物水解蛋白组成的PK细胞低血清培养基作为对照培养基1(即不含有实施例1中的第四组分)。将2g对照培养基1溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，加入2％血清，制得对照培养液1。在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液1转移到T75细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。对照例2除第四组分中不含有偏钒酸铵、亚硒酸、六水合三氯化铬和氟化钠之外，其它成分与实施例1的PK细胞低血清培养基相同，以该培养基作为对照培养基2。将2g对照培养基2溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液2。在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液2转移到T75细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。对照例3除第四组分中不含有二氧化锗、氯化铷、六水合氯化钴和八水氧氯化锆之外，其它成分与实施例1的PK细胞低血清培养基相同，以该培养基作为对照培养基3。将2g对照培养基3溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，加入2％血清，制得对照培养液3。在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液3转移到T75细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。对照例4除第四组分中不含有四水合二氯化锰、氯化镉、硫酸镍和氯化锂之外，其它成分与实施例1的PK细胞低血清培养基相同，以该培养基作为对照培养基4。将2g对照培养基4溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，加入2％血清，制得对照培养液4。在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液4转移到T75细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。对照例5除第四组分中不含有二氧化锗、偏钒酸铵、四水合钼酸铵、偏钒酸钠和六水合氯化铝之外，其它成分与实施例1的PK细胞低血清培养基相同，以该培养基作为对照培养基5。将2g对照培养基5溶于100ml超纯水中，搅拌混匀后，加入2g碳酸氢钠，搅拌混匀，制得对照培养液5。在无菌条件下，用已灭菌移液器将50ml的对照培养液5转移到T75细胞培养瓶中，向细胞培养瓶接种PK细胞悬液，接种密度为0.8×105个细胞/，在37℃温度、5％CO2条件下进行贴壁培养。培养48小时后的细胞计数及细胞活力结果见表14。表14各对照培养液培养后的细胞计数结果由表14可知：缺少本发明PK细胞低血清培养基中的第四组分或第四组分中的几种成分的培养基在用于培养PK细胞时细胞的密度和活力明显下降。由此说明，上述第四组分中的各成分在本发明的PK细胞低血清培养基中均是不可或缺的，其对PK动物细胞的培养具有显著作用。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页1 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