鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒突变株制备及其应用的制作方法

本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒突变株制备及其应用。

背景技术：

沙门菌是一种重要的食源性人兽共患病细菌，是研究最为广泛和深入的细菌之一，其中鸡白痢沙门菌主要存在于一些发展中国家。沙门菌可引起禽类的无症状隐性感染，但是在小于两周龄的幼雏中，有引起高发病率和全身性感染爆发的可能。鸡白痢沙门菌是一种宿主专嗜性病原菌，主要侵害20日龄以内的雏鸡，雏鸡感染后表现出典型的白色下痢症状，发病率和死亡率高。成年鸡感染呈现隐形带菌，无明显临床症状，可通过卵巢垂直传播给子代。因此，造成的危害和经济损失巨大。

国内常采用药物控制法，造成了细菌耐药性和药物残留等一系列问题。最近几年，许多国家逐渐转向使用疫苗预防来控制沙门菌，取得了很好的效果。近年来，利用基因工程技术将强毒株毒力相关基因敲除构建的新型减毒沙门菌用作疫苗的研究备受关注，新型减毒活疫苗安全性好、不易返祖；在减毒的同时不丧失免疫原性，并且可在免疫期内于免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应，可对病原体的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，比灭活疫苗和亚单位疫苗在预防控制鸡沙门菌的感染方面更有优势，因而是较为理想的疫苗。

技术实现要素：

鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒突变株制备及其应用。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株，为fur基因、speD基因和speE基因都不表达的鸡白痢沙门菌。

优选地，所述鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株，为fur基因、speD基因和speE基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。

野生型鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为：Accession:NC_021984.1；GI:529218781。只要将野生型鸡白痢沙门菌中的fur基因、speD基因和speE基因都进行敲除，使得fur基因、speD基因和speE基因都不表达，即可获得本发明所述鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株。

优选地，本发明一实施例中，被敲除的fur基因含有如SEQ ID NO：2所示的序列。

优选地，本发明一实施例中，speD基因和speE基因同时被敲除，被敲除的speD基因和speE基因含有如SEQ ID NO：5所示的序列。

进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。

所述的其他基因改造是指除fur基因、speD基因和speE基因三敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。

基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。

进一步地，本发明一实施例中，被敲除的fur基因被替换为如SEQ ID NO：3所示序列。被敲除的speD基因和speE基因被替换为如SEQ ID NO：6所示的序列。

上述如SEQ ID NO：3所示序列和如SEQ ID NO：6所示序列的引入，并不影响鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株的性能。

本发明的第二方面，提供了前述鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株的构建方法，包括步骤：将野生型鸡白痢沙门菌中的fur基因、speD基因和speE基因都敲除。

可以采用现有的基因编辑方法敲除所述fur基因、speD基因和speE基因。优选地，可采用同源重组的方法敲除fur基因、speD基因和speE基因。在优选的实施例中，采用Red同源重组的方法敲除fur基因、speD基因和speE基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。

基于fur基因的敲除，fur基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除；基于speD基因的敲除，speD基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中被去除；基于speE基因的敲除，speE基因的完整序列或部分序列从染色体DNA中去除。

在一实施例中，先构建fur基因敲除的鸡白痢沙门菌突变株，并在此基础上敲除speD基因和speE基因。

本发明的第三方面，提供了前述鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株在制备鸡白痢沙门菌活疫苗中的用途。

本发明的第四方面，提供了一种鸡白痢沙门菌活疫苗，含有前述鸡白痢沙门菌三基因敲除减毒株。

进一步的，所述鸡白痢沙门菌活疫苗中还含有佐剂。

本发明的第五方面，提供了fur基因、speD基因和speE基因共同作为靶基因在筛选鸡白痢沙门菌感染治疗药物中的用途。

本发明所述鸡白痢沙门菌感染治疗药物为以fur基因、speD基因和speE基因为治疗靶基因，使fur基因、speD基因和speE基因敲除、不表达的药物或者以fur基因、speD基因和speE基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以fur基因、speD基因和speE基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以fur基因、speD基因和speE基因为靶点，筛选使这三个基因不表达的药物，用于使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染。例如，该鸡白痢沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使fur基因、speD基因和speE基因敲除或不表达；或者通过制备fur蛋白拮抗剂、speD蛋白拮抗剂和speE蛋白拮抗剂，使fur基因、speD基因和speE基因表达的蛋白不发挥作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明旨研制了一种三基因敲除的鸡白痢沙门菌减毒株，本发明通过动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。

进一步的，采用所述减毒株做制备的鸡白痢沙门菌活疫苗，其毒力相对于野生型鸡白痢沙门菌显著降低。接种本发明鸡白痢沙门菌减毒活疫苗后，所述疫苗具有良好的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果。

附图说明

图1：质粒pKD46的图谱。

图2：质粒pKD4的图谱。

图3：是fur同源臂+卡那霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果，M：DL2000 DNA marker；1：λ-Red同源重组片段。

图4：fur-WYZ-F/R引物验证图，M：λ14DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子fur-WYZ-F/R引物验证。

图5：fur-NYZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子fur-NYZ-F/R引物验证。

图6：Kan-YZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子Kan-YZ-F/R引物验证。

图7：质粒pKD3的图谱。

图8：speDE同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果，M：DL2000 DNA marker；1：λ-Red同源重组片段。

图9：speDE-WYZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子speDE-WYZ-F/R引物验证。

图10：speDE-NYZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子speDE-NYZ-F/R引物验证。

图11：Cm-YZ-F/R引物验证图，M：DL2000 DNA marker；1：S06004(WT)阳性对照；2：转化子Cm-YZ-F/R引物验证。

图12：细菌在肝脏中的持续带菌情况。

图13：细菌在脾脏中的持续带菌情况。

图14：免疫试验结果。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)的构建

野生型鸡白痢沙门菌S06004来源：江苏省人兽共患病学重点实验室保存。

野生型鸡白痢沙门菌S06004的鉴定：

1.1 细菌鉴定

1.1.1 染色镜检：

革兰氏法染色后，普通光学显微镜下观察菌体形态、测量细菌大小。革兰氏染色结果显示镜检可观察到散在排列的红的短小直杆菌，大小约为1μm×4μm。

1.1.2 生化试验

挑取纯培养的单菌落，以革兰氏阴性生化鉴定卡鉴定其生化特性。细菌可发酵葡萄糖、甘露糖，不发酵麦芽糖、蔗糖、尿素酶，不产生硫化氢。

2.鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)突变株的筛选与鉴定

2.1 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur)的构建

2.1.1 引物

根据GeneBank上已发表的沙门菌基因组序列，野生型鸡白痢沙门菌S06004的fur基因的阅读框序列如SEQ ID NO：1所示。用引物设计软件Primer 5.0设计出特异性的fur上下游序列引物，用于λ-Red同源重组的引物由两部分组成，5’端大写的50bp的序列与靶基因两翼序列同源，3’端小写的序列与pKD4质粒上Kan抗性基因两侧序列同源，引物见表1：

表1

2.1.2 打靶片段的扩增与纯化

以质粒pKD4(图谱如图2所示)作为模板，表1中的引物进行PCR扩增，扩增反应体系如下表2所示：

PCR反应条件如下：94℃5min；94℃40sec，70℃40sec，72℃20sec，30cycles；72℃10min。反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒回收约1,500bp的PCR产物，具体操作按说明书进行，回收产物于-20℃保存。fur同源臂+卡那霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果如图3所示。

2.1.3 S06004-pKD46感受态细胞的制备

pKD46质粒的谱图如图1所示。将编码Red重组系统的质粒pKD46电转化导入鸡白痢沙门菌S06004感受态中构建S06004-pKD46，转化完成后涂布于含Amp的LB固体培养基上，30℃培养24h，培养完成后作为下一步转化的宿主菌。将此宿主菌在Amp抗性LB液体培养基中30℃，180rpm过夜培养，以1：25的接种量转接于50mL同样的培养基中，30℃，180rpm振荡培养至OD₆₀₀值约为0.2时加入终浓度为30mM的L-阿拉伯糖，继续振荡培养至OD₆₀₀值约为0.4-0.6。4℃，4,500rpm离心收集菌体，用无菌冷的ddH₂O洗3次，最后将菌体用100μL冷的无菌10％甘油重悬，-70℃冻存，作为基因重组片段电转化的感受态细胞。

2.1.4 fur基因重组片段电转化及阳性重组菌的筛选

将fur基因重组片段电转入S06004(pKD46)感受态中。具体方法为，将100ng基因重组片段(PCR产物的体积不能超过感受态细胞的10％)与20μL感受态细胞混合，冰浴3min，转移入电击杯中后，在电压1.8KV的参数下电击。电击完成后立即将37℃预热的SOC加入电击杯中，用移液枪吹打均匀，吸入1.5mL指形管内，于37℃，180rpm摇床内振荡培养2h。培养完成后，涂布于含Kan的LB固体培养基上，30℃过夜培养，筛选Kan^R转化子。用fur-WYZ-F/R，fur-NYZ-F/R和Kan-YZ-F/R引物对Kan^R转化子进行PCR验证，验证正确的菌株命名为ΔS06004(fur)(pKD46)。

fur-WYZ-F/R引物验证图如图4所示。fur-NYZ-F/R引物验证图如图5所示。Kan-YZ-F/R引物验证图如图6所示。

取验证正确的菌落于42℃，180rpm条件下培养以去除pKD46质粒，后命名为鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur)。亦即，野生型鸡白痢沙门菌S06004的fur基因中序列为SEQ ID NO：2的多核苷酸片段被缺失，替换成了序列为SEQ ID NO：3的卡那霉素抗性基因片段，从而获得所述鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur)。

2.2 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)的构建

2.2.1 引物

根据GeneBank上已发表的沙门菌基因组序列，野生型鸡白痢沙门菌S06004的speDE基因的阅读框序列如SEQ ID NO：4所示。用引物设计软件Primer 5.0设计出特异性的speDE上下游序列引物，用于λ-Red同源重组的引物由两部分组成，5’端大写的50bp的序列与靶基因两翼序列同源，3’端小写的序列与pKD3质粒上Cm抗性基因两侧序列同源，引物序列见表3：

表3

Cm-YZ-R SEQ ID NO：22 TCCTGGTGTCCCTGTTGA ΔspeDE:

2.2.2 打靶片段的扩增与纯化

以pKD3质粒(图谱如图7所示)为模板，表3中的引物进行PCR扩增，反应体系如下表4所示：

PCR反应条件如下：94℃5min；94℃40sec，70℃40sec，72℃20sec，30cycles；72℃10min。反应结束后，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用试剂盒回收约1,050bp的PCR产物，回收产物于-20℃保存。speDE同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果如图8所示。

2.2.3 ΔS06004(fur)(pKD46)感受态细胞的制备

方法同2.1.3。在感受态细胞制备时，用来培养ΔS06004(fur)(pKD46)的LB液体培养基中，加入Amp和Kan两种抗生素。

2.2.4 speDE基因重组片段电转化及阳性重组菌的筛选

将-20℃保存的用于缺失speDE基因的基因重组片段电转入S06004Δfur(pKD46)感受态细胞中。电转方法同2.1.4。电转完成后，37℃，180rpm振荡培养2h，涂布于含Kan和Cm的LB固体培养基上，30℃过夜培养，筛选Kan^R，Cm^R转化子，用fur-WYZ-F/R，fur-NYZ-F/R，speDE-WYZ-F/R，speDE-NYZ-F/R引物对Kan^R，Cm^R转化子进行PCR验证，验证正确的菌株命名为ΔS06004(fur，speDE)(pKD46)。

speDE-WYZ-F/R引物验证图如图9所示。speDE-NYZ-F/R引物验证图如图10所示。Cm-YZ-F/R引物验证图如图11所示。

取验证正确的菌株，去除pKD46质粒后命名为鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)。在鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur)的基础上，speDE基因中序列为SEQ ID NO：5的多核苷酸片段被缺失，替换成了序列为SEQ ID NO：6的氯霉素抗性基因片段，从而获得鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)。

实施例2 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)的安全型试验

安全性试验：3日龄海兰白雏鸡的致死率试验

将实施例1制备的ΔS06004(fur，speDE)突变株与野生株S06004的毒力比较。

细菌的培养：细菌在LB平板上37℃静置培养24h，挑取1个饱满单菌落在LB平板上全板划线，37℃静置培养24h，用灭菌PBS将LB平板上的细菌刮下，同时调整细菌浓度,分别以不同的剂量肌肉注射3日龄雏鸡。S06004野生株的注射剂量为1.0×10⁴CFU、1.0×10⁵CFU、1.0×10⁶CFU、1.0×10⁷CFU、1.0×10⁸CFU、1.0×10⁹CFU，ΔS06004(fur，speDE)的注射剂量为1.0×10⁸CFU、5.0×10⁹CFU、1.0×10⁹CFU、1.0×10¹⁰CFU，10羽/组，同时设立注射PBS的空白对照组。连续观察2周并统计死亡情况，统计死亡率。实验结果表明，ΔS06004(fur，speDE)突变株的毒力显著降低(表5)。

表5：野生株S06004和突变株对3日龄海兰白品系雏鸡的致死率

实施例3 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)在宿主体内的定殖试验

将ΔS06004(fur，speDE)以口服和肌肉注射两种方式感染3日龄雏鸡，肌注剂量为1.0×10⁷CFU/羽，口服剂量为2.0×10⁸CFU/羽，同时以口服S06004作为阳性对照组，剂量为1.0×10⁸CFU/羽。每只鸡口服、肌注量分别100μL，设立口服100μL PBS的空白对照组。鸡口服前需禁食禁水过夜。

分别在感染后4d，7d，10d，14d，21d剖杀试验鸡，5羽/组，无菌取其部分脾脏、肝脏，细菌计数。鸡肝脏中细菌数变化见图12，鸡脾脏中细菌数变化见图13。在检测的时间点内，野生菌感染组的肝脏和脾脏中的带菌量都明显高于突变株免疫组，突变株在肝脏和脾脏中最终被完全清除，在肝脏中，突变株在感染后10天检测不到，在脾脏中在21天检测不到。在整个试验过程中，阴性对照组始终未分离到细菌。

实施例4 鸡白痢沙门菌ΔS06004(fur，speDE)的免疫保护试验

免疫原性试验：IgG抗体检测

在实施例3的基础上，收集减毒株ΔS06004(fur，speDE)免疫组和PBS对照组的血清，进行间接ELISA检测IgG抗体。具体方法参见文献：徐步，高明燕，龚建森，吕晓娟，单艳菊，刘学贤，采用全菌抗原干燥包被法ELISA检测禽霍乱血清抗体的研究[J].中国家禽,2009,31(5):31-33。

结果如图14显示：免疫后第一周即可刺激机体产生IgG抗体，在第三周达到高峰。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。