本发明涉及一种阿维菌素高产菌株的高效筛选方法，属于微生物生产技术领域。
背景技术：
阿维菌素(Avermectins)是阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的内酯类抗生素由8个组分组成A1a、A2a、A1b、A2b、B1a、B2a、B1b和B2b，其中B1a组分作用效果最好。阿维菌素是一种高度亲脂性化合物，能够在有机溶剂中有高溶解度，如丙酮、乙醇、甲醇、氯仿等。阿维菌素作为一种广谱抗生素，具有低毒高效的特点，在农业、畜牧业、医药中被广泛使用。
阿维菌素作为阿维链霉菌次级代谢产物，其代谢存在复杂庞大的网络。尽管阿维菌素全基因组测序已经完成，但其生物合成过程复杂，受不同水平的调控，代谢途径也尚未清晰阐明。分子育种手段费用高，过程复杂。为了加快选育速度，建立一个简便、快速和准确的检测方法是有必要的。高通量筛选技术是在传统筛选技术的基础上，将生物化学、现代生物学、计算机、自动化控制等高新技术有机组合成一个高自动化的新模式，与传统随机筛选相比，高通量筛选周期和投资更低，成功机率高。从发酵工程微生物育种史，可以看到经典诱变育种是最主要的育种手段，也是最基础的育种手段，经典诱变结合高通量筛选仍可作为可靠的方法。
现有的阿维菌素菌株的筛选，一般是采用摇瓶发酵后用HPLC方法进行检测，存在培养周期长、检测所需时间长、检测方法繁琐等缺陷。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种阿维菌素高产菌株的高效筛选方法。本发明方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、酶标仪检测和高通量筛选技术，提高阿维菌素高产菌株的筛选效率。
所述出发菌株阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)由齐鲁制药(内蒙古)有限公司提供。
本发明的阿维菌素高产菌株的高效筛选方法，主要包括步骤如下：
(1)将待筛选的阿维链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；
(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；
(3)发酵结束后，吸取发酵液加入95％乙醇稀释至阿维菌素浓度为0～210μg/mL，于30KHZ、功率40W下超声1min，离心取上清液200μL上清液于96孔酶标板，测定240nm可见光下的吸收值OD240nm，根据y＝0.01781x+0.06292(其中y为OD240nm，x为阿维菌素浓度、单位μg/mL)计算得到阿维菌素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的阿维菌素浓度，即得到产阿维菌素相对较高的菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：可溶性淀粉4g，酵母提取物3.5g，麦芽提取物8g，CoCl2·6H2O 5mg，琼脂粉20g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的种子培养液(g/L)：玉米淀粉28.5g，豆饼粉7.5g，酵母粉4.5g，酵母膏4g，CoCl230mg，淀粉酶0.67g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)的96浅孔板中培养是在750r/min、28℃摇床培养45～47h。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养液(g/L)：玉米淀粉140g，豆饼粉25g，酵母粉10g，(NH4)2SO40.25g，CoCl2·6H2O 20mg，NaMoO422mg，MnSO42.3mg，淀粉酶0.67g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养是将种子液以8％(v/v)的接种量转接至48孔板中，于28℃、750r/min发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)的离心是在4000r/min离心15min。
在本发明的一种实施方式中，所述待筛选的阿维链霉菌菌悬液，是将阿维链霉菌进行诱变后得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)96浅孔板中种子培养液添加量为150μL/孔。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)48孔板中发酵培养液的添加量为900μL/孔。
本发明的有益效果：
本发明建立了一种新型筛选方法，此方法极大地简化了整个筛选过程。本发明方法对固体培养基进行优化，有效提高了孢子生长速度，有效提高了后续筛选效率。同时，对从发酵液中提取阿维菌素的方法进行了改进，有效提高了提取效率，防止了提取效果不佳导致的筛选准确性不足的问题。
具体实施方式
阿维菌素的测定：高效液相色谱(HPLC)
仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18
流动相：90％甲醇+10％超纯水
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
进样量：10μL
紫外检测器波长：245nm(检测阿维菌素)
样品制备：称取1g发酵液，用无水乙醇适当稀释，超声浸提20min，5000rpm离心15min，吸取上清经0.22μL滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。
致死率的计算：
其中A表示空白对照平板上的菌落形成单位个数，B表示经过诱变处理后平板上的菌落形成单位个数。
所需培养基：
固体平板培养基1号(g/L)：可溶性淀粉4g，酵母提取物3.5g，麦芽提取物8g，CoCl2·6H2O 5mg，琼脂粉20g。
固体平板培养基2号(g/L)：酵母提取物4g，麦芽提取物10g，葡萄糖4g，CaCO32g，琼脂粉20g。
固体平板培养基3号(g/L)：可溶性淀粉1g，NaCl 0.05g，磷酸氢二钾0.3g，(NH4)2SO4 0.2g，硫酸镁0.1g，轻质碳酸钙0.5g，琼脂粉20g。
固体平板培养基4号(g/L)：可溶性淀粉5g，麦芽提取物2g，大豆蛋白胨2g，CoCl2·6H2O 5mg
固体平板培养基5号(g/L)：可溶性淀粉1g，(NH4)2SO40.625g，NaCl 0.15g，CaCO30.75g，琼脂粉20g。
种子培养基(g/L)：玉米淀粉28.5g，豆饼粉7.5g，酵母粉4.5g，酵母膏4g，CoCl230mg，淀粉酶0.67g。
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉140g，豆饼粉25g，酵母粉10g，(NH4)2SO40.25g，CoCl2·6H2O 20mg，NaMoO422mg，MnSO42.3mg，淀粉酶0.67g。
实施例1：最佳固体平板培养基选择
配制五中不同配方的固体平板培养基，将稀释后的无菌阿维链霉菌菌悬液涂布于固体平板培养基上。观察菌落形态以及生长速度。发现阿维链霉菌在1号固体平板培养基上生长快且孢子丰满，能够有效提高后续筛选效率。而阿维链霉菌在2号固体平板培养基上生长较慢，在3号斜面培养基上生长缓慢，在4号、5号斜面上不生长。
实施例2：ARTP诱变
出发菌株斜面菌种在28℃，培养5天至孢子成熟。刮取适量孢子于装有2mL无菌生理盐水试管中，震匀制成菌悬液后，无菌滤纸过滤。吸取10μL菌悬液均匀涂布于无菌的载片表面，将载片置于ARTP诱变仪载台上，用ARTP诱变仪进行诱变。条件：入射功率为100W、氦气流量为10SLM、分别照射0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s，样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有1mL生理盐水的EP管中，充分震荡后梯度稀释。分别吸取100μL稀释液涂布固体平板上(每组做3组平行)。28℃恒温培养箱中培养5天后，孢子成熟。计数每块平板上的菌落形成单位个数，再计算出每个诱变处理时间的致死率，进而得到在入射功率为100W，氦气流量为10SLM条件下的致死曲线，先前的研究工作者认为致死率在80％-100％左右的突变效果最好。其他物理或化学诱变方法也可用于后续的筛选流程。
实施例3：酶标仪检测
根据阿维菌素在240nm处有最大光吸收，而空白培养基在240nm处无吸收值的这一特点，选择酶标仪检测阿维菌素作为初筛方法。配置一定浓度梯度的标准品(标准品浓度范围为0～210μg/mL)，用酶标仪检测，制得标准曲线方程y＝0.01781x+0.06292，R2＝0.99913(其中y为OD240nm，x为阿维菌素标准品浓度、单位μg/mL)。48孔板中的预发酵实验表明阿维菌素的效价在1000μg/mL左右。吸取48深孔板中培养液50μL，95％乙醇将阿维菌素稀释到标准曲线线性范围之内，于30KHZ、功率40W下超声1min浸提后4000r/min离心15min，取200μL上清液于96酶标板，用酶标仪测定240nm可见光下的吸光值OD。
实施例4：高产菌株的筛选
将ARTP或其他诱变技术处理后的菌悬液稀释成合适的浓度。吸取100μL的菌悬液均匀涂布在平板上，于28℃恒温培养箱中培养5d，利用QPix 420仪器或类似菌落挑选设备或手工挑取平板上诱变单菌落于96浅孔板(装有种子培养液180μL)中，在750r/min、28℃的孔板摇床上培养45h。以8％(v/v)的接种量，将96孔板中的种子液平行转接至48孔板(装有发酵培养液900μL)中，28℃，750r/min发酵培养10d。
发酵结束后，吸取发酵液加入95％乙醇稀释至阿维菌素浓度为0～210μg/mL，于30KHZ、功率40W下超声1min，离心取上清液200μL上清液于96孔酶标板，测定240nm可见光下的吸收值OD240nm，根据y＝0.01781x+0.06292(其中y为OD240nm，x为阿维菌素浓度、单位μg/mL)计算得到阿维菌素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的阿维菌素浓度，即得到产阿维菌素相对较高的菌株。
实施例5：筛选方法的准确性验证
将实施例4的待筛选菌株采用摇瓶培养并用HPLC方法进行检测，结果显示，实施例4方法得到的结果，与摇瓶+HPLC方法得到的结果一一对应，即实施例4得到的产阿维菌素相对较高的菌株也是摇瓶+HPLC方法得到的相对较高的菌株。说明，实施例4的方法准确性好、可靠性强。
此外，发明人还研究了提取条件对检测准确性的影响，结果发现，采用95％乙醇稀释，于30KHZ、功率40W下超声1min能够有效提取发酵液中的阿维菌素，提高最终检测的准确性。而采用75％或者无水乙醇进行稀释，阿维菌素浓度与OD240nm的线性关系受到影响，会影响检测结果而最终导致部分高产菌株被筛选剔除；也曾尝试采用延长或者明显缩短超声处理的时间、或者采用60KHZ功率100W超声、采用30KHZ功率20W超声等条件，结果发现会对阿维菌素的提取结果发生明显影响而导致最终检测准确性不足。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。