一种体外诱导记忆性b细胞转化为浆细胞的制备方法
【专利摘要】一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法,本发明是利用含CpG2006、IL-2、IL-10、B95-8细胞培养上清及胎牛血清的RPMI-1640培养基，诱导从血液中分离的记忆性B细胞分化成为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体的方法，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。本发明相较于其他B细胞诱导技术，本发明需要细胞数量少，诱导效率高，针对性强。
【专利说明】一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]记忆B细胞是在初次免疫反应后，产生IgM抗体的B细胞转为产生IgG的一种B细胞。记忆B细胞是机体重要的免疫细胞，在体液免疫中扮演着十分重要的角色，对浆细胞的产生、抗体的生成以及持久的免疫保护起关键的作用。
[0003]记忆性B细胞在接种牛疫疫苗后能持续50年，而体液中抗体通常会在抗原清除后衰减。大多数的乙肝疫苗接种者在接种后的几年内都会失去保护性抗体，但乙肝病毒特异性的记忆性B细胞可以持续存在，在乙肝病毒或疫苗再次暴露的情况下，能够提供快速保护性抗体反应。
[0004]因此，记忆性B细胞的分析可以用来鉴定特定已知抗原的过去抗体反应，从而对针对特定病原体或抗原的抗体特异性和保护免疫相关联的血清学研究形成补充。此外，记忆性B细胞的分析不仅可以鉴定出新的治疗用抗体，还开发出了一种无需使用杂交瘤细胞融合、噬菌体展示或EBV转化就可制备特异性结合已知抗原的完全人单克隆抗体的新方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对血清学分析抗体表达谱的不足，提供一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法。
[0006]本发明是利用含CpG2006、IL_2、IL-10, B95-8细胞培养上清及胎牛血清的RPM1-1640培养基，诱导从血液中分离的记忆性B细胞分化成为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体的方法，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。
[0007]本发明所述制备方法包括下列步骤:
1.饲养细胞的制备与保存:采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞，经过6ciCo辐照后使人外周血淋巴细胞丧失增殖能力，从而作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞；
2.诱导液的配置:按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分:2.5 μ g/mL 的 CpG2006,10ng/mL 的 IL-2,10ng/mL 的 IL-10,体积百分比 25% 的 B95-8 细胞培养上清，体积百分比10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPM1-1640培养基中，混匀；
3.记忆性B细胞的诱导:将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞，再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒分离获得记忆性B细胞，计数后，按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在37°C，5%C02条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞；
4.浆细胞阳性孔的筛选:收集步骤(3)中的细胞培养上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测B细胞上清特异性，看是否分泌所需蛋白。
[0008]本发明的有益效果:相较于血浆抗体的分析，本发明采用体外诱导记忆性B细胞分化为浆细胞，从而分泌出RSV特异性抗体，这些抗体包括过去感染过RSV，但随着时间衰减而血清学监测不到的抗体。
[0009]
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为人外周血单个核细胞(PBMCs)数目；
图2为B淋巴细胞数目；
图3为记忆性B淋巴细胞数目；
图4是7号阳性孔筛选结果。
【具体实施方式】
[0011]1、饲养细胞的制备与保存:采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞,经过6ciCo辐照后的人的外周血淋巴细胞丧失增殖能力，可以作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞。细胞计数后，于液氮罐冻存。
[0012]2、体外诱导 记忆性B细胞转化为浆细胞的细胞培养液的制备:按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分:2.5 μ g/mL的CpG2006,10ng/mL的IL-2，10ng/mL的IL-10，25%的B95-8细胞培养上清，10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPM1-1640培养基中，混匀。
[0013]3、PBMCs的分离及记忆性B细胞的分选、活化培养:将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞(periphery blood mononuclear cell,PBMC)，进行细胞计数，如图1人外周血单个核细胞(PBMCs)数目；再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒先分离出B细胞,进行细胞计数,如图2是B淋巴细胞数目；再从B细胞中分离获得记忆性B细胞，再进行细胞计数，如图3是记忆性B淋巴细胞数目。按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在370C，5%C02条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞。
[0014]实施例2:浆细胞阳性孔的筛选
使用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测细胞上清。首先将针对Rsv的不同抗原混合检测，具体操作如下:
1、包板:用10ng/孔的GL和10ng/孔的FL包被酶标板，4°C过夜。洗板机洗板5遍。洗液为含0.05% Tween的PBS。
[0015]2、封闭:用5%脱脂奶200 μ L /孔，37°C封闭2h，洗板5遍。
[0016]3、加入一抗:加入适当稀释的Rsv标准抗体和活化培养的记忆性B细胞的细胞上清，同时用水和1640培养基作为阴性对照，50 μ L /孔，37°C放置lh。洗板5遍。
[0017]4、加入二抗:加入1:1000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG，50 μ L/孔，37°C放置45min,洗板5遍。
[0018]5、显色:加入TMB显色液100 μ L/孔，室温避光显色20min，6、终止检测:加入2Mol/L硫酸50 μ I/孔终止显色反应，检测0D450nm，参考波长为630nmo
[0019] 其中样本7 号的检测结果如图4所示。
【权利要求】
1.一种体外诱导记忆性B细胞转化为浆细胞的制备方法，其特征是: (O饲养细胞的制备与保存:采集人的新鲜抗凝血，用淋巴细胞分离液分离出人的外周血淋巴细胞，经过6tlCo辐照后使人外周血淋巴细胞丧失增殖能力，从而作为人记忆性B细胞培养的饲养层细胞； (2)诱导液的配置:按加入成分占终产物的质量体积比或体积百分比加入如下成分:。2.5 μ g/mL 的 CpG2006,10ng/mL 的 IL-2，10ng/mL 的 IL-10,体积百分比 25% 的 B95-8 细胞培养上清，体积百分比10%的胎牛血清，将以上成分加入到RPM1-1640培养基中，混匀； (3)记忆性B细胞的诱导:将新鲜肝素钠抗凝全血样本用人淋巴细胞分离液分离，获得人外周血单个核细胞，再用人记忆性B细胞磁珠分选试剂盒分离获得记忆性B细胞，计数后，按照200细胞/孔的密度接种到96孔U型底培养板，每孔加入200mL的培养液和50000个饲养细胞，在37°C，5%C02条件下培养两周，让记忆性B细胞活化成为浆细胞； (4.)浆细胞阳性孔的筛选:收集步骤(3)中的细胞培养上清，使用呼吸道合胞病毒抗原G蛋白和F蛋白包被的酶标板，采用酶联免疫吸附测定方法检测B细胞上清特异性，看是否分泌所需蛋 白。
【文档编号】C12N5/071GK104031880SQ201410284437
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】陈廷涛, 辛洪波, 魏强 申请人:南昌大学