一种棉花柱头外露基因的分子鉴定方法与流程

文档序号:12743903阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤(1):对棉花柱头外露基因进行DNA提取;

步骤(2):以棉花柱头外露基因ob1的序列特征为依据设计引物,

第一正向引物 5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’ (SEQ ID No.1),

第一反向引物 5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’ (SEQ ID No.2),

以SEQ ID No.1所示第一正向引物和SEQ ID No.2所示第一反向引物对步骤(1)得到的DNA进行PCR扩增,95℃预变性2min,94℃变性30sec,55℃退火45sec,72℃延伸45sec,30个循环;72℃延伸10min,4℃保存;

步骤(3):以棉花柱头外露基因ob2的序列特征为依据设计引物,

第二正向引物 5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’ (SEQ ID No.3),

第二反向引物 5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’ (SEQ ID No.4),

以SEQ ID No.3所示第二正向引物和SEQ ID No.4所示第二反向引物对步骤(1)得到的DNA进行PCR扩增,95℃预变性2min,94℃变性30sec,55℃退火45sec,72℃延伸45sec,30个循环;72℃延伸10min,4℃保存;

步骤(4),对步骤(2)和(3)得到的扩增产物进行电泳检测并采用银染的方法染色,若步骤(2)产物在255出现特异性条带,而步骤(3)产物在153bp处无扩增条带,而且仅在145bp处有特异扩增条带,则同时含有ob1和ob2基因,表现柱头外露。

2.根据权利要求1所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:棉花柱头外露基因进行DNA提取的具体方法为:

取棉花材料真叶期幼嫩叶片500mg,加液氮碾磨粉碎,置于离心管中,然后向离心管中加入1000µlDNA提取液,混匀后,65℃水浴30min,且每间隔10min轻摇下;

水浴结束后,再向离心管中加入800µl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂,混合均匀后,离心分离;

吸取上清液,加入2µl浓度为10mg/ml RNase酶,混匀后,37℃水浴30min;然后再加入1000µl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂,混合均匀后,离心分离;

取上清液,加入体积为上清液体积0.7倍的异丙醇,静置30min,絮状DNA成团析出;

将絮状DNA取出,用体积浓度为70%的乙醇浸泡,浸泡两次,每次10min,再用无水乙醇浸泡过夜后,倒掉乙醇,倒置管壁晾干后,加入ddH2O,温室溶解2h,测定浓度后稀释到25ng/µl,-20℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述的DNA提取液中含有:0.05M Tris-Cl,0.01 M EDTA,2% SDS,1% PVP,0.5%山梨醇,0.705M NaCl和1% β-巯基乙醇,pH值为8.0,高压灭菌;其中,1% β-巯基乙醇为使用前加入,体系中的%代表体积分数。

4.根据权利要求2所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述的混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

5.根据权利要求2所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述的离心分离的速度为12000rpm,时间为10min。

6.根据权利要求1所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述步骤(2)具体方法如下:

取1µl浓度为25ng/µl的DNA溶液与9µl PCR反应液混合,进行PCR反应;其中,PCR反应液中含有以下物质:10×PCR Buffer 1.0µl,10mM dNTPs 0.2µl,25mM MgCL2 0.8µl,10mM SEQ ID No.1所示第一正向引物0.5µl,10mM SEQ ID No.2所示第二反向引物0.5µl,2U/µl TaqDNA聚合酶0.2µl和ddH2O 5.8µl。

7.根据权利要求1所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:步骤(4)具体方法如下:

向步骤(2)和(3)得到的扩增产物中分半加入2µl溴酚蓝混匀,制备浓度为6%(质量比)的聚丙烯酰胺凝胶,在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测;电泳结束后采用银染的方法进行染色,具体步骤如下:固定液中固定10min;染色液中染色12min;用蒸馏水快速洗两遍,在显色液中显色5min,直至条带清晰为止;蒸馏水速洗两遍,放入终止液中终止反应;若步骤(2)产物在255出现特异性条带,而步骤(3)产物在153bp处无扩增条带,而且仅在145bp处有特异扩增条带,则为柱头外露;若缺少任一特异性条带,则不表现为柱头外露。

8.根据权利要求7所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述的电泳检测的电泳电压为220伏,电流为164毫安,时间为50min。

9.根据权利要求7所述的棉花柱头外露基因的分子鉴定方法,其特征在于:所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液;所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于 300ml蒸馏水,即得;所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后,再加入3ml的浓度为0.2%(质量比)硫代硫酸钠溶液,混合均匀,即得;所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水,即得。

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