一种棉花柱头外露基因的分子鉴定方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柱头外露基因鉴定和分子标记辅助育种的分子鉴定方法。

背景技术：

柱头外露是指棉花中花器官的一种突变性状。表现为植株现蕾后不久（一般12~20天），柱头伸出，高出花冠，而雄蕊仍被包裹在花冠内，直到开花雄蕊才露出散粉，而且上半部（柱头基部）雄蕊花药往往表现坏死，导致柱头授粉困难，成铃率很低。由于柱头外露的特性，这种种质也称雌雄异熟系。这种突变体往往出现于棉花的海陆杂交后代中。前人研究结果表明柱头外露性状受2对隐性基因控制，即柱头外露性状携带基因型为ob1ob1ob2ob2，其中任一位点携带显性基因则表型为野生型（正常花）。

由于柱头外露材料自交率低，可不去雄杂交授粉，简化制种工序，从而比人工去雄制种降低成本约40%以上；另外，从杂交种育种的雄性不育三系配套的角度，柱头外露系可一系两用，同时作为保持系和不育系，因此其在棉花的杂种优势利用上具有较大的应用价值。但是，在传统依靠表型鉴定得育种程序中，由于每次回交转育后都需要进行自交鉴定，以确柱头外露基因在转育和改良过程中没有丢失，而柱头外露受两对隐性基因控制，柱头外露单株在分离群体出现的概率较低，从而需要耗费大量的棉田、人力和财力。采用常规育种技术选育和改良柱头外露材料需要较长年限。因此，如何通过分子标记辅助选择方法稳定可靠又快速简便的进行柱头外露材料的选育和改良成为本发明的关键核心。

分子标记直接从DNA水平反映出核苷酸序列的差异，它不受发育阶段、环境因素以及基因是否表达的影响，具有数量非常丰富，遗传稳定等特点。目前，随着分子生物学的飞速发展，分子标记检测技术已经发展出几十种技术可用于分子标记的筛选，比较常用的有RFLP 、RAPD、ISSR、SSR、SCAR、STS、AFLP和SNP等，随着分子标记技术的不断发展和应用，目前，国内外已经越来越多的将各种分子标记技术应用在作物育种材料的分子标记辅助选择育种中。等位基因特异扩增(AS-PCR)是指等位基因特异引物可以分别与野生型和突变型结合,进行特异扩增得到等位基因特异PCR产物，用以开发基因的功能标记。目前在其他作物中已有很多基于AS-PCR 的基因功能标记被开发出来。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种；解决了现有技术所存在等的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本棉花柱头外露基因的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）：对棉花柱头外露基因进行DNA提取；

步骤（2）：以棉花柱头外露基因ob1的序列特征为依据设计引物，

第一正向引物 5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’ （SEQ ID No.1），

第一反向引物 5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’ （SEQ ID No.2），

以SEQ ID No.1所示第一正向引物和SEQ ID No.2所示第一反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

步骤（3）：以棉花柱头外露基因ob2的序列特征为依据设计引物，

第二正向引物 5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’ （SEQ ID No.3），

第二反向引物 5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’ （SEQ ID No.4），

以SEQ ID No.3所示第二正向引物和SEQ ID No.4所示第二反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

步骤（4），对步骤（2）和（3）得到的扩增产物进行电泳检测并采用银染的方法染色，若步骤（2）产物在255出现特异性条带，而步骤（3）产物在153bp处无扩增条带，而且仅在145bp处有特异扩增条带，则同时含有ob1和ob2基因，表现柱头外露。

作为优选，棉花柱头外露基因进行DNA提取的具体方法为：

取棉花材料真叶期幼嫩叶片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于离心管中，然后向离心管中加入1000µlDNA提取液，混匀后，65℃水浴30min，且每间隔10min轻摇下；

水浴结束后，再向离心管中加入800µl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心分离；

吸取上清液，加入2µl浓度为10mg/ml RNase酶，混匀后，37℃水浴30min；然后再加入1000µl苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心分离；

取上清液，加入体积为上清液体积0.7倍的异丙醇，静置30min，絮状DNA成团析出；

将絮状DNA取出，用体积浓度为70%的乙醇浸泡，浸泡两次，每次10min，再用无水乙醇浸泡过夜后，倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入ddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/µl，-20℃保存备用。

作为优选，所述的DNA提取液中含有：0.05M Tris-Cl，0.01 M EDTA，2% SDS，1% PVP，0.5%山梨醇，0.705M NaCl和1% β-巯基乙醇，pH值为8.0，高压灭菌；其中，1% β-巯基乙醇为使用前加入，体系中的%代表体积分数。

作为优选，所述的混合溶剂中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

作为优选，所述的离心分离的速度为12000rpm，时间为10min。

作为优选，所述步骤（2）具体方法如下：

取1µl浓度为25ng/µl的DNA溶液与9µl PCR反应液混合，进行PCR反应；其中，PCR反应液中含有以下物质：10×PCR Buffer 1.0µl，10mM dNTPs 0.2µl，25mM MgCL2 0.8µl，10mM SEQ ID No.1所示第一正向引物0.5µl，10mM SEQ ID No.2所示第二反向引物0.5µl，2U/µl TaqDNA聚合酶0.2µl和ddH2O 5.8µl。

作为优选，步骤（4）具体方法如下：

向步骤（2）和（3）得到的扩增产物中分半加入2µl溴酚蓝混匀，制备浓度为6%（质量比）的聚丙烯酰胺凝胶，在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测；电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸馏水快速洗两遍，在显色液中显色5min，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液中终止反应；若步骤（2）产物在255出现特异性条带，而步骤（3）产物在153bp处无扩增条带，而且仅在145bp处有特异扩增条带，则为柱头外露；若缺少任一特异性条带，则不表现为柱头外露。作为优选，所述的电泳检测的电泳电压为220伏，电流为164毫安，时间为50min。

作为优选，所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液；所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于 300ml蒸馏水，即得；所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后，再加入3ml的浓度为0.2%（质量比）硫代硫酸钠溶液，混合均匀，即得；所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水，即得。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

（1）速度快：基因特异标记鉴定对辅助选育柱头外露基因的棉花品系具有重要作用。在柱头外露的回交转育过程中，涉及大量的自交鉴定等试验，并且需要调查大量的外部性状，需要投入大量的时间、人力和物力，且易受环境因素影响，因此，常规手段并不能完全准确、真实地反映柱头外露材料的遗传情况。本发明只需提供棉花材料的种子或叶片，提取DNA后，用基因特异引物对进行分子标记鉴定，利用相应分子鉴定体系可以很快地鉴定出柱头外露基因，同时利用本发明可以在柱头外露育种的分子标记辅助选择过程中有效跟踪柱头外露基因的存在与否，免去自交鉴定，从而极大加快柱头外露选育和改良过程。

（2）准确率高：本发明的基因特异标记具有简单、稳定可靠、重复性好等优点，很容易通过PCR快速扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。本发明利用一对基因特异引物对柱头外露进行鉴定，其与柱头外露性状完全共分离，可靠性高，且分子鉴定不受环境因素的影响，真正从DNA水平上鉴定柱头外露的遗传情况，提高了准确性。

（3）实用简单：本发明鉴定柱头外露基因和分子标记辅助选择育种的整个程序只是几次机械式的加样过程，易于操作，具有很好的商业化应用前景。

总之，本发明提供的基因特异标记及其引物能够快速鉴定携带柱头外露基因的棉花品系，其鉴定方法简单实用，其鉴定结果准确可靠，所以本发明提供的基因特异标记及其引物能够快速有效的辅助棉花育种，对推动育种进程起了决定性的作用。

附图说明

图1为本发明基因特异引物在基因位置的示意图；其中，虚线方框内区域为ob1和ob2相对于野生型基因缺失片段。

图2为本发明柱头外露材料及其后代的基因特异标记分析；其中， M：marker，1：陆地棉标准系“TM-1”，2：海岛棉DH系“3-79”，3：柱头外露材料“CS-B18”，其为以TM-1染色体组为背景，染色体18被3-79相应染色体代换的染色体代换系，4-43：从(TM-1×CS-B18)×CS-B18的BC1F1群体中随机选取的40株柱头外露单株，箭头为特异条带。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

Tris-Cl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸[Tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl]；EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid); SDS: 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate);PVP: 聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)

所有试剂购买自：生工生物工程（上海）股份有限公司；纯度为：分析纯。

1 、DNA提取

步骤1，取含柱头外露的海岛棉品种新海18、陆地棉标准系TM-1以及在TM-1×新海18的F2群体中随机选取的30株柱头外露单株共32个材料，于田间生长的5片真叶期取幼嫩叶片500mg，加液氮碾磨粉碎，置于2ml的离心管中；加入1000µlDNA提取液，漩涡混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇下；所述的DNA提取液中含有：0.05M Tris-Cl，0.01 M EDTA，2% SDS，1% PVP，0.5%山梨醇，0.705M NaCl和1% β-巯基乙醇，pH值为8.0，高压灭菌；其中，1% β-巯基乙醇为使用前加入，体系中的%代表体积分数；

水浴结束后，加入800µl体积比25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；

吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入2µl 10mg/ml RNase酶，混匀后37℃水浴30min；然后加入1000µl体积比25:24:1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶剂，上下颠倒混匀至不分层，12000rpm离心10min；

用剪口枪头吸取上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出；用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的2ml硅化离心管中，浸泡两次，每次十分钟，再无水乙醇浸泡过夜；倒掉乙醇，倒置管壁晾干后，加入200µl ddH2O，温室溶解2h，测定浓度后稀释到25ng/µl，-20℃保存备用，得到DNA样品。

2 基因特异标记：

以棉花柱头外露基因ob1的序列特征为依据设计引物，

第一正向引物 5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’ （SEQ ID No.1），

第一反向引物 5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’ （SEQ ID No.2），

以SEQ ID No.1所示第一正向引物和SEQ ID No.2所示第一反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

步骤（3）：以棉花柱头外露基因ob2的序列特征为依据设计引物，

第二正向引物 5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’ （SEQ ID No.3），

第二反向引物 5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’ （SEQ ID No.4），

以SEQ ID No.3所示第二正向引物和SEQ ID No.4所示第二反向引物对步骤（1）得到的DNA进行PCR扩增，95℃预变性2min，94℃变性30sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

PCR反应液中含有以下物质：10×PCR Buffer 1.0µl，10mM dNTPs 0.2µl，25mM MgCL2 0.8µl，10mM SEQ ID No.1所示正向引物0.5µl，10mM SEQ ID No.2所示反向引物0.5µl，2U/µl TaqDNA聚合酶0.2µl和ddH2O 5.8µl。

扩增结束后，在步骤（2）、（3）扩增产物中加入2µl溴酚蓝混匀，制备浓度为6%（质量比）的聚丙烯酰胺凝胶，在1×TBE的电泳缓冲液中电泳检测，电泳电压为220伏，电流为164毫安，时间为50min；电泳结束后采用银染的方法进行染色，具体步骤如下：固定液中固定10min；染色液中染色12min；用蒸馏水快速洗两遍，在显色液中显色5min，直至条带清晰为止；蒸馏水速洗两遍，放入终止液中终止反应；若步骤（2）产物在255出现特异性条带，而步骤（3）产物在153bp处无扩增条带，而且仅在145bp处有特异扩增条带，则为柱头外露；若缺少任一特异性条带，则不表现为柱头外露。

其中，所述的固定液为40ml体积浓度为95%的乙醇、2ml的纯乙酸和358ml的蒸馏水的混合溶液；所述的染色液的制备方法为将0.6g硝酸银溶于 300ml蒸馏水，即得；所述的显色液的制备方法为先将6g氢氧化钠和5ml甲醛加入400ml蒸馏水中混合均匀后，再加入3ml的浓度为0.2%（质量比）硫代硫酸钠，混合均匀，即得；所述的终止液的制备方法为将3g碳酸钠溶于400ml蒸馏水，即得。

结果如图1、图2所示，43个材料以ob01引物对（SEQ ID No. 1和2）进行扩增，在255bp有特征带，41个柱头外露类型材料都扩增出特征带。43个材料以ob2引物对（SEQ ID No. 3和4）进行扩增，在145bp有特征带，41个柱头外露类型材料都扩增出特征带。

其中序列表:

SEQ ID No.1

5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’；

SEQ ID No.2

5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’；

SEQ ID No.3

5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’；

SEQ ID No.4

5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

SEQ ID No.1

5’- TATTTCAGCTTCAAGCCATTCGT -3’；

SEQ ID No.2

5’- TGTTGTCCAGTTCCTCTTTTTCAG -3’；

SEQ ID No.3

5’- GAGAGTGCTAGGCTCGAAGCAGAA -3’；

SEQ ID No.4

5’- CACTACGCTTTGCCATGCTTTAAC -3’