本发明属于生物
技术领域：
，特别是提供了一种金藻与光合细菌混合发酵的方法，具体是提供了一种球等鞭金藻与沙氏外硫红螺菌混合发酵的方法。
背景技术：
：球等鞭金藻属于金藻门、普林藻纲、等鞭藻目、等鞭藻科。具有细胞膜薄、没有细胞壁、蛋白质含量高、易被鱼虾蟹贝类消化吸收的特点，在水产经济动物生产中被广泛应用在众多微藻中，金藻由于个体小、无细胞壁、细胞膜薄、易消化，油脂及多不饱和脂肪酸含量高等优点，而成为一种研究价值极高的经济藻类。但是金藻对温度、光照强度及营养因子等条件要求苛刻，且易受其他微藻及原生动物等各种微生物的污染。较难实现大规模培养，因此，如何提高金藻的生长速率及培养密度成为目前值得研究的一个课题。王雪青等通过培养条件的优化，最终能得到球等鞭金藻的量达2.989×106个/ml。沙氏外硫红螺菌，专性自养菌，厌氧菌，相对地耐氧，在空气中驯化可生长，单个细胞无色，细胞悬液的颜色最初呈显黄色到橙棕色，后来为棕红色到粉红色。PH最适范围：8-8.5，最适生长温度30-35℃；沙氏外硫红螺菌有较大的适应范围，10-40℃、500-6000lux和PH7-9.5，盐度为千分之三十五以下，均能适应生长，在微好氧黑暗状态下也能生存，条件不适时，该菌的生长处于抑制状态，一旦条件允许，又能继续生长。光合电子供体：硫化物，硫、硫代硫酸盐，分子氢、醋酸盐、丁酸盐、丙酸盐、苹果酸盐、乳酸盐。氮源：铵盐、谷氨酸盐、天门冬氨酸盐。能进行同化型的硫酸盐还原作用，具有较强的降解硫化氢，亚硝酸盐的能力，具有较好的净水效果。在水产动物苗种培育过程中，由于水质净化与营养饵料的要求较多及对营养的平衡需要,经常对不同动物或不同生长阶段的相同动物同时投喂不同微藻与光合细菌，而生产上是分别以单一品种培养后再加以混合的投喂方式进行,这对维持不同微藻与光合细菌的单种培养及其最佳数量比例的提供是一个难题。解决该难题的有效方法之一是开发高效的共培养体系。然而，共培养并非单种培养下的简单组合，其生长特性和生化成份与单种培养相比存在较大的差异。已有研究显示，影响共培养生长的因子较多,如温度、盐度、光照、营养盐以及接种密度等，尽管张金燕等在专利号CN101363005中已经公开了一种微细藻类和光合细菌共培养的方法，但其主要公开的是一种小球藻和沼泽红假单胞菌两种淡水藻与菌的培养方法，虽然在球等鞭金藻或沙氏外硫红螺菌培养方面都有报道，但是在如何利用球等鞭金藻与沙氏外硫红螺菌的各自生理生态特点，实现二者在同一培养基及理化条件下都能够快速生长并达到较高的生物量方面却未见研究报道。而且没有公开过海水藻与菌的混合培养方法，本发明公开的金藻与光合细菌混合发酵的方法在生产上可充分利用空间和资源，在应用上可实现菌藻优势互补，因此在规模化生产藻菌方面具有非常重要的应用价值。而且现有的单一培养的微藻的液体保存时间短，无法做为商品藻进行出售，也是一个限制因素。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种金藻和光合细菌混合发酵的方法，具体的是提供一种能够大大延长保质期，大大提高金藻菌体含量的一种金藻与沙氏外硫红螺菌混合发酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻与紫硫光合细菌中的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：⑴沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中，25-30℃，光照强度为：1000-6000lux，光照培养7-10天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；⑵沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度25-30℃，光照强度为：1000-6000lux，光照厌氧培养7-10天，检测种子的OD650≥1.2，活菌数≥6亿cfu/ml即为种子培养液；⑶球等鞭金藻种子培养：将球等鞭金藻接种到2000mL三角烧瓶中的金藻培养基进行活化纯培养,光照为3000lx,温度为27℃,不充气培养,每天摇动搅拌6次,培养4-9天，待球等鞭金藻的含量≥100万个/ml，即为球等鞭金藻种子培养液；⑷发酵培养：将球等鞭金藻种子培养液与发酵培养基以1：4-1：8的接种量接种，同时将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：10-1：15的接种量接入，在光照培养罐中间歇通气培养，培养温度25-28℃，光照强度为：1000-6000lux，搅拌速度为80转/分钟，光暗比为12L：12D，即每天12小进光照，12小时黑暗培养，利用磷酸调PH，使PH不高于8.5，培养6-10天，待血球计数板检测其沙氏外硫红螺菌不低于30亿cfu/ml，球等鞭金藻不低于4000万个/ml，即可放罐，灌装，包装成品。其中，所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为:氯化铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，碳酸氢钠1-3g/L,醋酸钠2-5g/L，九水硫化钠0.1-1g/L，琼脂8-10g/L，氯化钠20-30g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；其中，所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵0.8-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，二水氯化钙0.05-0.2g/L，氯化镁0.1-0.5g/L，醋酸钠2-10g/L,碳酸氢钠1-3g/L，氯化钠20-30g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液体培养基为:硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.01g，微量元素1ml，复合维生素1ml,海水1L,121℃灭菌15分钟；其中，所述的发酵培养基：硝酸钠0.1g，氯化铵0.8g/L，氯化钾0.5g/L，EDTA二钠0.5g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钠2g/L，硅酸钠0.01g/L，微量元素1ml，复合维生素1ml,用磷酸调PH至7.2-7.5。其中，所述的微量元素组成为：4.5g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌30mg，氯化锰0.2g，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜10mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，柠檬酸铁4g，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟；其中，所述的复合维生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸馏水1L，过滤除菌。本发明所培养的金藻和光合细菌都属于光合微生物，虽然它们进行光合作用的代谢途径和机理不同，但在共同培养条件下可以对培养基的高效利用产生协同作用。如光合细菌在好氧和厌氧不同条件下有多种代谢途径，对有机物代谢的产物二氧化碳可以被金藻利用，同时金藻通过光合作用产生的氧气可以有助于光合细菌通过好氧方式利用有机物。因此，金藻与光合细菌共同培养不仅能够使培养基的成分得到充分利用，而且各自本身所具有的生理生态特点也可以使二者同时受益，促进共同生长。本发明的优点在于：球等鞭金藻和沙氏外硫红螺菌混合发酵时，在共同培养条件下能够使球等鞭金藻和沙氏外硫红螺菌同时持续快速生长，且最终获得较高的生物量，实现了产业化生产出高细胞浓度的藻菌培养物，可以作为水产养殖饵料和净水剂等进行应用。单独发酵的藻液在常温下保存时由于藻体代谢旺盛，老化及杂菌增长等原因影响藻液的保存效果。由此，随着保存时间的延长，藻体生理活动的延续，水体中营养的消耗，水体中积累的藻体代谢物必然增加，且藻体自身携带杂菌可能也不断增长，消耗水体溶氧以及营养从而导致藻体活性降低。球等鞭金藻和沙氏外硫红螺菌混合发酵后，可使混合菌藻液保存过程中增加藻液中溶氧，藻体代谢物得以适当分解，抑制了藻液中有害细菌的增长，减少有害物质的积累；其次减轻了藻体的自氧化，减缓老化，增强自身活性，提升了整体成活率。因此，明显延长了球等鞭金藻的保存时间，可使用保存时间从2个月延长至4-6个月。具体实施方式实施例1一种金藻与光合细菌混合发酵的方法，其特征在于，采用球等鞭金藻与紫硫光合细菌中的沙氏外硫红螺菌菌种按以下步骤进行培养：⑴沙氏外硫红螺菌半固体种子活化培养：将沙氏外硫红螺菌种穿刺在半固体沙氏外硫红螺菌培养基中，30℃，光照强度为：4000lux，光照培养8天，待穿刺的菌线变红并长出菌苔，即可为活化的沙氏外硫红螺菌种；⑵沙氏外硫红螺菌种子培养：将活化的菌种接种至沙氏外硫红螺菌种子液体培养基中，温度30℃，光照强度为：4000lux，光照厌氧培养8天，检测种子的OD650为1.3，活菌数为6.5亿cfu/ml即为种子培养液；⑶球等鞭金藻种子培养：将球等鞭金藻接种到2000mL三角烧瓶中的金藻培养基进行活化纯培养,光照为3000lx,温度为27℃,不充气培养,每天摇动搅拌6次,培养8天，待球等鞭金藻的含量110万个/ml，即为球等鞭金藻种子培养液；⑷发酵培养：将球等鞭金藻种子培养液与发酵培养基以1：6的接种量接种，同时将沙氏外硫红螺菌种子培养液与发酵培养基按1：12的接种量接入，在光照培养罐中间歇通气培养，每小时通气5分钟，每分钟通气量为液体培养基的0.2倍，培养温度28℃，光照强度为：5000lux，搅拌速度为80转/分钟，光暗比为12L：12D，即每天12小进光照，12小时黑暗培养，利用磷酸调PH，使PH不高于8.5，培养9天，待血球计数板检测其沙氏外硫红螺菌为32亿cfu/ml，球等鞭金藻为4100万个/ml，即可放罐，灌装，包装成品；其中，所述的半固体沙氏外硫红螺菌培养基为:氯化铵0.9g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1/L，氯化镁0.3g/L，碳酸氢钠3g/L,醋酸钠3g/L，九水硫化钠0.2g/L，琼脂9g/L，氯化钠25g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2,其中九水硫化钠先配制成0.1g/mL单独灭菌；其中，所述的沙氏外硫红螺菌种子液体培养基为：氯化铵1.0g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，二水氯化钙0.1g/L，氯化镁0.3g/L，醋酸钠4g/L,碳酸氢钠3g/L，氯化钠25g/L,121℃灭菌15分钟，用醋酸调PH至7.0-7.2；其中，所述的金藻液体培养基为:硝酸钠0.1g，磷酸二氢钾0.01g，微量元素1ml，复合维生素1ml,海水1L,121℃灭菌15分钟；其中，所述的发酵培养基：硝酸钠0.1g，氯化铵0.8g/L，氯化钾0.5g/L，EDTA二钠0.5g/L，氯化镁0.2g/L，醋酸钠4g/L，碳酸氢钠6g/L，氯化钠2g/L，硅酸钠0.01g/L，微量元素1ml，复合维生素1ml,用磷酸调PH至7.2-7.5；其中，所述的微量元素组成为：4.5g，硫酸亚铁0.5g，浓硫酸0.05ml，硫酸锌30mg，氯化锰0.2g，硼酸30mg，氯化钴20mg，氯化铜10mg，氯化镍2mg，钼酸钠3mg，柠檬酸铁4g，蒸馏水1000毫升，PH3-4，121℃灭菌15分钟；其中，所述的复合维生素：VB1100mg，VB120.5mg，蒸馏水1L，过滤除菌。实施例2混合金藻与光合细菌发酵的有效期试验试验组：混合金藻与光合细菌发酵，初始金藻含量为4100万个/ml，每隔一个月检测其金藻的成活率；对照组：常规培养的金藻，初始金藻含量为320万个/ml，每个月检测其成活率。指标测定成活率测定：使用I-KI试剂对藻体进行染色，以确定存活细胞和死亡细胞，以1:1体积比将I-KI试剂添加至菌藻液，用血球计数板在显微镜下计数存活细胞；活藻细胞除以初始藻细胞量即为成活率。试验结果：如表1可以看出，混合发酵中的金藻半年后成活率还可以达到51.2%，而对照组只在常温下存活90天存活率只有45.4%，另外，按金藻的净含量即使保存了半年后，其存活藻含量也达到了2099万个/ml，远远高于常规培养的藻含量（初始金藻含量为320万个/ml）。表1金藻常温保存成活率的变化。时间/成活率30天60天90天120天150天180天试验组98.6%93.7%88.9%79.9%65.8%51.2%对照组82.4%66.4%45.4%21.8%10.4%4.1%实施例3混合发酵的金藻与光合细菌在海湾扇贝(Argopectonirradians)幼体及稚贝培育期水质净化剂及辅助饵料育苗生产试验2015年2月8日-3月20日，在湛江市覃斗镇某海水育苗场80m3水体育苗池中，每天施用量为1L金藻与光合细菌混合发酵液；试验结果：浮游幼体生长速度提高了38.4%，浮游期成活率提高60.3%，幼体提前40个小时出现眼点，稚贝变态平提高24.5%，产量提高195%，取得了显著效果。当前第1页1 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