一株高效降解氮污染物的芽孢杆菌及其复合菌制剂的制作方法

本发明专利属于微生物及其应用领域，尤其涉及一株高效降解氮污染物的芽孢杆菌，为白翎芽孢杆菌BBHS-01，可高效降解水产养殖水体氮污染物，能应用于水产养殖的水环境调控以及微生态修复，能净化水质、显著改善养殖水环境；本发明还涉及一种以上述白翎芽孢杆菌BBHS-01为主要成分的复合菌制剂；本发明还涉及一种以上述白翎芽孢杆菌BBHS-01为主要成分的复合菌制剂的制备方法。

背景技术：

20世纪80年代以来，在野生资源匮乏受限和广大消费市场需求的驱动下，我国水产养殖业迅猛发展，养殖集约化程度越来越高，与此同时，养殖水体污染日益加剧，其中在集约化养殖污染中以氮污染尤为突出。

养殖水体中的氮主要以分子态氮、有机氮、无机氮形式存在。在无机态氮中，氨氮和亚硝氮态氮对养殖水生动物具有强烈地毒害作用，甚至会引起养殖生物死亡。有研究表明，凡纳滨对虾对氨氮和亚硝氮的耐受浓度分别为2.667mg/L和5.551mg/L。此外水体中的氮含量过高，会造成养殖水体中的浮游植物过量生长，大量消耗水体的氧气，严重影响养殖生物的正常生活和生长。因此水产养殖中的高浓度的氨氮和亚硝氮成为影响养殖生物生长和健康、制约养殖发展的重要因素。

为了提高水产养殖动物的生长速度，过量的投饵导致大量残饵的累积，残饵中溶解出的有机氮等有害物质不易被分解，水体中氮的累积超过养殖生物的 耐受范围会对养殖动物产生直接的毒害作用。

随着微生物技术的发展，利用有益微生物进行微生物调控来改善和净化水质，受到越来越多的关注和研究。已有研究者提出微生物在养殖池塘中起着至关重要的作用，降解微生物在水产养殖中具有净化水质、改善和修复养殖水环境的功能。近年，利用有益降解微生物研制成益生菌或复合菌制剂产品直接投入到水体中使用，用以改善和修复养殖水环境的研究越来越多，已有学者研究发现芽孢杆菌等复合菌制剂可有效的降解水体中的有机污泥，促进罗非鱼(Tilapia)生长；另有学者在实验水族箱内添加荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)1d后，测得水体中的亚硝酸盐和氨氮含量分别降低了70％-81％和35％-41％；此外，已有学者研究了在罗非鱼(Tilapia)养殖过程中使用菌制剂的作用，研究发现水体中的氨氮和亚硝氮含量明显降低，养殖水体底层溶氧增加，养殖水质明显改善。

由于应用于养殖水环境调控的益生菌制剂具有针对性和适应性差等缺点，因此从养殖水体、底质环境中分离筛选有益的菌株并以此为基础制成菌制剂，在水产养殖水环境调控与修复的应用中具有极为深远的意义。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种可应用于水产养殖的水环境调控以及微生态修复的菌株——白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)，其具有高效降解养殖水体氮污染物的功效，能净化水质、显著改善养殖水环境。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案，一株高效降解氮污染物的芽孢杆菌，为白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)，于2012年12月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC NO.6939，保藏地址为北京市朝阳区大屯路 中国科学院微生物研究所。

一种上述高效降解氮污染物的芽孢杆菌——白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)在降解水产养殖污染物中的应用。

所述芽孢杆菌——白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的降解性能主要包括对无机氮的降解方面，该菌株筛选自对虾养殖池塘。

经发明人深入研究，从对虾养殖池塘底泥中分离驯化筛选获得了上述可作为添加物可以高效降解水体无机氮的白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)。所述白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的主要特征如下：

1、形态特征：

形态为杆状，能运动，可产生芽孢，二分裂生殖，菌体单个、两两或短链相聚。

2、培养特征：

在海水2216E基础培养基或对虾饵料培养基(市售对虾饵料20g研成细粉，灭菌陈海水1000ml，浸泡48h后离心取上清，加琼脂25g，调pH 7.8，121℃，灭菌20min)上于(5～45)℃下生长，其最适生长温度范围为(18～28)℃，最佳温度范围为(24～28)℃，其生长pH范围为4～10，生长最适pH范围为7.5～8.0，其最适生长的NaCl浓度范围为30‰～60‰，28±1℃在2216E基础培养基或对虾饵料培养基上培养24h的菌落直径可达1.8mm左右，菌落呈菌落呈乳白色、圆形、扁平、不透明、边缘整齐、表面较干燥粗糙。在(0-6)h白翎芽孢杆菌处于生长调整期，(6-22)h为生长对数期，生长速度明显加快，尤其是(6-10)h内，菌体生长最快，22h后菌株进入生长稳定期和衰亡期。

3、生理生化特征：

菌株革兰氏阳性，芽孢染色阳性，油脂水解酶阳性，淀粉水解酶阳性，接 触酶阳性，V-P试验阴性，葡萄糖氧化发酵产产气、明胶阳性、乳糖阳性、麦芽糖阳性、甘露醇阴性、甘露糖阳性、蔗糖阴性、阿拉伯糖阴性、木糖阴性。

4、菌株鉴定

根据芽孢杆菌——白翎芽孢杆菌BBHS-01和相关菌株的16SrDNA构建的系统发育树最终确定菌株为白翎芽孢杆菌属(Bacillus baekryungensis)的细菌。

5、降解特性

实验表明，所述芽孢杆菌——白翎芽孢杆菌BBHS-01对水体中的氨氮(NH₄-N)、亚硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分别高达63.43％、93.98％、70.37％，可见该菌株在水产养殖中的具有很大的应用潜力。

本发明的另一目的是提供一种以上述芽孢杆菌为主要成分的复合菌制剂，所述复合菌制剂是由白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以6～8:1:1的细菌数比例复合而成。

所述枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均购自青岛根源生物技术集团公司。所述复合菌制剂能够有效的去除养殖水体中的污染物，改善养殖环境。经发明人反复研究表明，将上述各菌株以6～8:1:1的细菌数比例混合的优点是不仅菌株生长快、无拮抗作用，而且所制得的复合菌制剂对水体中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的降解率高。

本发明还提供了一种上述以白翎芽孢杆菌BBHS-01为主要成分的复合菌制剂的制备方法，所述复合菌制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种活化与纯化：将白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种到改良后的2216E固体培养基上，于28℃培养22小时；所述改良后的2216E固体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL、琼脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分 为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，调节pH为7.6，121℃、101KPa灭菌30min；挑取单菌落接种到2216E固体斜面培养基，于28℃纯化培养20小时，所得的试管斜面菌株为固体纯化菌株，所述2216E固体斜面培养基所含成分同改良后的2216E固体培养基；

(2)制作三角瓶液体菌种：将试管斜面菌株分别接种于改良后的2216E液体培养基上，于28℃、160rpm培养20小时，得到各菌株的三角瓶液体菌种；所述改良后的2216E液体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素组分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制备：将培养好的各菌株的三角瓶液体菌种按照白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以6～8:1:1的细菌数比例接种到2216E液体培养基中，于28℃、160rpm培养20小时，得到三菌株的三角瓶混合液体菌种；

(5)复合菌制剂的制备：

a.将酵母粉、蛋白胨、氯化钠、豆粕粉、麦麸皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均匀，制成培养基固型物；

b.将沸石粉、花生粕和麦饭石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作为辅料填充物；

c.将海泥用粉碎机粉碎，过100目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的10倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70～80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液， 滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液；

d.称取以下重量份数的各组分：碎木屑12～15份、麦秸10～12份、桑叶10～12份、浮萍9～10份、白杨树皮9～10份、鱼鳞5份、苦瓜4～5份、芦根1份、干酒糟1份、干酵母1份、贝壳粉1份，将称量好的各组分混匀，并向混合物中加入等量的纯化水，搅拌混匀，放入玻璃容器，28℃～30℃条件下避光发酵56小时，得发酵产物，将所得发酵产物用100目筛网过滤，取过滤所得的发酵液；

e.将培养基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液体菌种按照4：1：60的重量比例均匀混合，然后置于发酵罐内于28℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为4V/V.min，培养5d，得到混合发酵菌液；

f.将辅料填充物、发酵液、膨润土、混合发酵菌液按照1：1～2：1：8～9的重量比混合，置于50℃烘干机烘干，粉碎，制成复合菌制剂。

步骤(5)的d操作步骤中，将所得发酵产物用100目筛网过滤，取过滤所得的发酵液的作用是防止发酵产物中的固体残渣进入养殖水体，避免对养殖水体带来二次污染。

优选地，所述沸石粉和麦饭石粉的粒径为100目，所述膨润土的粒径为150目。由于比表面积的大小会对吸附效果产生影响，因此本发明的膨润土与沸石粉和麦饭石粉形成了不同比表面积的颗粒组团，实验结果表明，将膨润土与沸石粉和麦饭石粉粉碎至不同的粒径，有利于提高膨润土、沸石粉和麦饭石粉之间的协同吸附作用，进而提高复合菌制剂对水产养殖污染物和氮污染物的降解率。

优选地，步骤(4)中，芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌 以7:1:1的细菌数比例接种到2216E液体培养基中。

优选地，步骤(5)的d操作步骤中，称取的各组分的重量份数如下：碎木屑15份、麦秸12份、桑叶10份、浮萍10份、白杨树皮9份、鱼鳞5份、苦瓜4份、芦根1份、干酒糟1份、干酵母1份、贝壳粉1份。

优选地，步骤(5)的f操作步骤中，辅料填充物、发酵液、膨润土混合发酵菌液按照1：2：1：8的重量比混合。

在本发明中，复合菌制剂对水体中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分别为93.27％、100.00％和92.09％，复合菌制剂的降解效果显著优于单菌株，可见芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对氮污染物的降解作用方面具有协同作用，提高了白翎芽孢杆菌BBHS-01对氮污染物的降解率，此外，本发明的复合菌制剂具有存储和使用方便的优点，在水产养殖中具有广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明的白翎芽孢杆菌BBHS-01对水体中的氨氮(NH₄-N)、亚硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分别高达63.43％、93.98％、70.37％，在水产养殖中的具有很大的应用潜力；(2)将白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以6～8:1:1的细菌数比例混合的优点是不仅菌株生长快、无拮抗作用，而且所制得的复合菌制剂对水体中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的降解率高，对水体中的NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分别为93.27％、100.00％和92.09％，复合菌制剂的降解效果优于单菌株，可见白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对氮污染物的降解作用方面具有协同作用；(3)本发明的复合菌制剂具有存储和使用方便的优点，在水产养殖中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的白翎芽孢杆菌BBHS-01的生长曲线；

图2为白翎芽孢杆菌BBHS-01及相关菌株的基于16SrDNA基因序列的系统发育树。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1白翎芽孢杆菌的主要特征及其对水体污染物的降解实验

1.所述白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)的主要特征如下：

(1)形态特征：

形态为杆状，能运动，可产生芽孢，二分裂生殖，菌体单个、两两或短链相聚。

(2)培养特征：

在海水2216E基础培养基或对虾饵料培养基(市售对虾饵料20g研成细粉，灭菌陈海水1000ml，浸泡48h后离心取上清，加琼脂25g，调pH 7.8，121℃，灭菌20min)上于(5～45)℃下生长，其最适生长温度范围为(18～28)℃，对对虾饵料成分降解的最佳温度范围为(24～28)℃，其生长pH范围为4～10，生长和饵料降解的最适pH范围为7.5～8.0，其最适生长的NaCl浓度范围为30‰～60‰，(28±1)℃在2216E基础培养基或对虾饵料培养基上培养24h的菌落直径可达1.8mm左右，菌落呈菌落呈乳白色、圆形、扁平、不透明、边缘整齐、表面较干燥粗糙。在(0-6)h白翎芽孢杆菌处于生长调整期，(6-22)h为生长对数期，生长速度明显加快，尤其是(6-10)h内，菌体生长最快，22h后菌株进入生长稳定期和衰亡期，其生长曲线见附图1。

(3)生理生化特征：

菌株革兰氏阳性，芽孢染色阳性，油脂水解酶阳性，淀粉水解酶阳性，接触酶阳性，V-P试验阴性，葡萄糖氧化发酵产产气、明胶阳性、乳糖阳性、麦芽糖阳性、甘露醇阴性、甘露糖阳性、蔗糖阴性、阿拉伯糖阴性、木糖阴性。

(4)菌株鉴定

根据白翎芽孢杆菌BBHS-01和相关菌株的16SrDNA构建的系统发育树最终确定菌株为白翎芽孢杆菌属(Bacillus baekryungensis)的细菌(见图2，其中BBHS-01为本发明的菌株白翎芽孢杆菌)。

(5)降解特性

实验表明，所述白翎芽孢杆菌BBHS-01对水体中的氨氮(NH₄-N)、亚硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)的去除率分别高达63.43％、93.98％、70.37％，可见该菌株在水产养殖中的具有很大的应用潜力。

2.所述白翎芽孢杆菌BBHS-01(Bacillus baekryungensis)对水体污染物的降解实验：

(1)对虾饵料固体平板生长情况检测：

从对虾养殖池塘底泥中分离筛选出白翎芽孢杆菌BBSH-01(保藏号为：CGMCC NO.6939)，该菌株于28±1℃在20g/L的对虾饵料培养基(市售对虾饵料20g研成细粉，灭菌陈海水1000ml，浸泡48h后离心取上清，加琼脂25g，调pH 7.8，121℃，灭菌20min)上长势好，生长迅速，培养24的菌落直径可达2mm左右。

(2)对虾饵料浸出液的降解效果检测：

1)白翎芽孢杆菌BBHS-01对对虾饵料浸出液的降解效果实验

实验所用的降解液：为市售对虾饵料20g研成细粉，灭菌陈海水1000ml，浸泡48h后离心取上清，加亚硝酸钠0.058g，调pH 7.8，分装成100mL/瓶，于 121℃，灭菌20min。

将白翎芽孢杆菌BBHS-01的24h活化培养物8000r/min离心10min，以无菌生理盐水洗剂沉淀菌体，并稀释成含1×10⁶CFU/mL的菌液，然后将菌液按1％的比例加至100mL的对虾饵料降解液中，28±1℃、160r/min下震荡培养5d，每天定时取样，测定样品液中的氨氮(NH₄-N)、亚硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)含量，菌体生长量采用光电比浊法以OD₆₀₀表示，以不加菌作为对照处理，每个处理设3次重复。

2)实验结果

实验结果分别见表1和表2。实验结果表明：白翎芽孢杆菌BBHS-01对对虾饵料降解液具有明显的降解效果，在实验期间随着该菌株的生长，可显著降解饵料降解液中的无机氮成分，其中对NH₄-N、NO₂-N、NO₃-N的最高降解率分别为63.43％、93.98％、70.37％。

表1白翎芽孢杆菌BBHS-01于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

表2白翎芽孢杆菌BBHS-01于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

实施例2白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的拮抗实验

三菌株的拮抗实验：分别取白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌与2216E固体培养基划线，置于28℃培养24h后，分别挑取单菌落在2216E固体培养基上进行两两交叉十字划线，将划线的平板于28℃培养24h后，检查菌株生长情况，拮抗实验划线培养结果表明三菌株均不存在拮抗作用。

实施例3复合菌制剂的制备方法

本实施例的复合菌制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种活化与纯化：将白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种到改良后的2216E固体培养基上，于28℃培养22小时；所述改良后的2216E固体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL、琼脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，调节pH为7.6，121℃、101KPa灭菌30min；挑取单菌落接种到2216E固体斜面培养基，于28℃纯化培养20小时，所得的试管斜面菌株为固体纯化菌株，所述2216E固体斜面培养基所含成分同改良后的2216E固体培养基；

(2)制作三角瓶液体菌种：将试管斜面菌株分别接种于改良后的2216E液体培养基上，于28℃、160rpm培养20小时，得到各菌株的三角瓶液体菌种；所述改良后的2216E液体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素组分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制备：将培养好的各菌株的三角瓶液体菌种按照白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以7:1:1的细菌数比例接种到2216E液体培养基中，于28℃、160rpm培养20小时，得到三菌株的三角瓶混合液体菌种；

(5)复合菌制剂的制备：

a.将酵母粉、蛋白胨、氯化钠、豆粕粉、麦麸皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均匀，制成培养基固型物；

b.将沸石粉和麦饭石粉分别粉碎，并过100目筛，将沸石粉、花生粕和麦饭石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作为辅料填充物；

c.将海泥用粉碎机粉碎，过100目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的10倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70～80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份数称取以下各组分：碎木屑15份、麦秸12份、桑叶10份、浮萍10份、白杨树皮9份、鱼鳞5份、苦瓜4份、芦根1份、干酒糟1份、干酵母1份、贝壳粉1份，将称量好的各组分混匀，并向混合物中加入等量的纯化水，搅拌混匀，放入玻璃容器，28℃～30℃条件下避光发酵56小时，得发酵产物，将所得发酵产物用100目筛网过滤，取过滤所得的发酵液；

e.将培养基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液体菌种按照4：1：60的重量比例均匀混合，然后置于发酵罐内于28℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为4V/V.min，培养5d，得到混合发酵菌液；

f.将膨润土粉碎并过150目筛，将辅料填充物、发酵液、膨润土、混合发酵 菌液按照1：2：1：8的重量比混合，置于50℃烘干机烘干，粉碎，制成复合菌制剂。

实施例4复合菌制剂的制备方法

本实施例的复合菌制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种活化与纯化：将白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种到改良后的2216E固体培养基上，于28℃培养22小时；所述改良后的2216E固体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL、琼脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，调节pH为7.6，121℃、101KPa灭菌30min；挑取单菌落接种到2216E固体斜面培养基，于28℃纯化培养20小时，所得的试管斜面菌株为固体纯化菌株，所述2216E固体斜面培养基所含成分同改良后的2216E固体培养基；

(2)制作三角瓶液体菌种：将试管斜面菌株分别接种于改良后的2216E液体培养基上，于28℃、160rpm培养20小时，得到各菌株的三角瓶液体菌种；所述改良后的2216E液体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素组分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制备：将培养好的各菌株的三角瓶液体菌种按照白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以8:1:1的细菌数比例接种到2216E液体培养基中，于28℃、160rpm培养20小时，得到三菌株的三角瓶混合液体菌种；

(5)复合菌制剂的制备：

a.将酵母粉、蛋白胨、氯化钠、豆粕粉、麦麸皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均匀，制成培养基固型物；

b.将沸石粉和麦饭石粉分别粉碎，并过100目筛，将沸石粉、花生粕和麦饭石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作为辅料填充物；

c.将海泥用粉碎机粉碎，过100目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的10倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70～80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份数称取以下各组分：碎木屑14份、麦秸10份、桑叶10份、浮萍9份、白杨树皮9份、鱼鳞5份、苦瓜4份、芦根1份、干酒糟1份、干酵母1份、贝壳粉1份，将称量好的各组分混匀，并向混合物中加入等量的纯化水，搅拌混匀，放入玻璃容器，28℃～30℃条件下避光发酵56小时，得发酵产物，将所得发酵产物用100目筛网过滤，取过滤所得的发酵液；

e.将培养基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液体菌种按照4：1：60的重量比例均匀混合，然后置于发酵罐内于28℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为4V/V.min，培养5d，得到混合发酵菌液；

f.将膨润土粉碎并过150目筛，将辅料填充物、发酵液、膨润土、混合发酵菌液按照1：1：1：9的重量比混合，置于50℃烘干机烘干，粉碎，制成复合菌制剂。

实施例5复合菌制剂的制备方法

本实施例的复合菌制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种活化与纯化：将白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种到改良后的2216E固体培养基上，于28℃培养22小时；所述改良后的2216E固体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL、琼脂25.0g以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素成分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄，调节pH为7.6，121℃、101KPa灭菌30min；挑取单菌落接种到2216E固体斜面培养基，于28℃纯化培养20小时，所得的试管斜面菌株为固体纯化菌株，所述2216E固体斜面培养基所含成分同改良后的2216E固体培养基；

(2)制作三角瓶液体菌种：将试管斜面菌株分别接种于改良后的2216E液体培养基上，于28℃、160rpm培养20小时，得到各菌株的三角瓶液体菌种；所述改良后的2216E液体培养基的培养基配方如下：蛋白胨6.0g、酵母粉3.0g、陈海水1000mL以及微量元素液1ml，所述微量元素液的微量元素组分为：0.4g/L的K₂HPO₄·3H₂O，0.3g/L的MgSO₄·7H₂O，0.5g/L的MnSO₄，0.1g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CuSO₄；

(4)混合菌液的制备：将培养好的各菌株的三角瓶液体菌种按照白翎芽孢杆菌BBHS-01、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌以6:1:1的细菌数比例接种到2216E液体培养基中，于28℃、160rpm培养20小时，得到三菌株的三角瓶混合液体菌种；

(5)复合菌制剂的制备：

a.将酵母粉、蛋白胨、氯化钠、豆粕粉、麦麸皮和水以2：6：1：1：2：10的重量比混合均匀，制成培养基固型物；

b.将沸石粉、花生粕和麦饭石粉以1：1：1的重量比例混合，所得混合物作 为辅料填充物；

c.将海泥用粉碎机粉碎，过100目筛，过筛后加入提取罐中，将质量浓度为50％的酒精加入提取罐中，酒精用量为海泥重量的10倍，开启搅拌，将提取罐置于恒温水浴摇床，在140rpm、70～80℃条件下提取30min，100目过滤取滤液，滤渣返回提取罐中重复提取一次，100目过滤取滤液，合并两次所得滤液，得海泥浸出液；

d.按照下列重量份数称取以下各组分：碎木屑12份、麦秸12份、桑叶12份、浮萍10份、白杨树皮10份、鱼鳞5份、苦瓜5份、芦根1份、干酒糟1份、干酵母1份、贝壳粉1份，将称量好的各组分混匀，并向混合物中加入等量的纯化水，搅拌混匀，放入玻璃容器，28℃～30℃条件下避光发酵56小时，得发酵产物，将所得发酵产物用100目筛网过滤，取过滤所得的发酵液；

e.将培养基固型物、海泥浸出液、三角瓶混合液体菌种按照4：1：60的重量比例均匀混合，然后置于发酵罐内于28℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为4V/V.min，培养5d，得到混合发酵菌液；

f.将辅料填充物、发酵液、膨润土、混合发酵菌液按照1：2：1：9的重量比混合，置于50℃烘干机烘干，粉碎，制成复合菌制剂。

实施例6实施例3～实施例5所得的复合菌制剂对水体污染物的降解实验

1、复合菌制剂对对虾饵料浸出液的降解效果实验

实验所用的降解液：为市售对虾饵料20g研成细粉，灭菌陈海水1000ml，浸泡48h后离心取上清，加亚硝酸钠0.058g，调pH 7.8，分装成100mL/瓶，于121℃，高压灭菌20min。

分别取实施例3～实施例5所得的复合菌制剂1mg，分别添加到100mL的对虾饵料降解液中，28±1℃、160r/min下震荡培养5d，每天定时取样，测定样 品液中的氨氮(NH₄-N)、亚硝酸氮(NO₂-N)和硝酸氮(NO₃-N)含量，菌体生长量采用光电比浊法以OD₆₀₀表示，以不加菌制剂的作为对照处理，每个处理设3次重复。

2、实验结果

实验结果分别见表3～表6。实验结果表明：复合菌制剂对对虾饵料降解液具有明显的降解效果，在实验期间随着细菌的生长，可显著降解饵料降解液中的无机氮成分，其中对NH₄-N、NO₂-N以及NO₃-N的最高降解率分别为93.27％、100.00％和92.09％，复合菌制剂对污染物的降解效果优于单菌株。

表3实施例3所得的复合菌制剂于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

表4实施例3所得的复合菌制剂于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

表5实施例4所得的复合菌制剂于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

表6实施例5所得的复合菌制剂于不同培养时间对饵料降解液的降解效果(1～5d)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进应视为本发明的保护范围。