一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂及其制备方法与流程

文档序号:12457070阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂,其特征在于,所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂主要由以下几种菌:污色原毛平革菌,桔绿木霉,米曲霉,解淀粉芽孢杆菌,普纳链霉菌发酵制成;其具体的制备方法,包括以下步骤:

步骤一,复合曲霉菌粉的制备

A、污色原毛平革菌种子液的制备:取出污色原毛平革菌菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml,即为污色原毛平革菌种子液;

B、桔绿木霉种子液的制备:取出桔绿木霉菌菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复苏,30℃培养6天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养4-6天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为桔绿木霉种子液;

C、米曲霉种子液的制备:取出米曲霉菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复苏,30℃培养5天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养5-7天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为1亿cfu/ml,即为米曲霉种子液;

D、混合发酵:将上述制备的污色原毛平革菌种子液、桔绿木霉种子液与米曲霉种子液以2:1:1的比例混合均匀后,以2%的接种量接种至灭菌的曲霉固体发酵培养基上,菌种与固体培养基混合均匀后,将接好种的曲霉固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,湿度保持为60%-75%,发酵6-10天,检测其总孢子含量不低于20亿CFU/g,检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于10亿CFU/g,木质素过氧化物酶活,即LiP酶活不低于200U/ g;锰依赖过氧化物酶,即MnP酶活不低于500U/ g;纤维素酶含量不低于500IU/ g,木聚糖酶含量不低1000IU/ g,即可低温风干,水分含量低于10%,即得到复合曲霉菌粉;

其中,所述的PDA固体培养基:土豆200g,蔗糖20g,水1000mL,琼脂20g;

其中,所述的曲霉固体发酵培养基:香蕉茎叶渣85%,棉粕2%,玉米芯8%,石粉1%,粗玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤二、解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备

取出解淀粉芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养48小时,在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于20亿cfu/ml,即可作为芽孢杆菌液体种子;

发酵:将上述制备的芽孢杆菌液体种子加至芽孢固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于100亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,即得到解淀粉芽孢杆菌菌粉;

其中,所述营养肉汁固体培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂20 g,水1000mL,pH7.2;

其中,所述液体种子培养基:葡萄糖8g/L,玉米粉10 g/L, 豆粉10 g/L,硫酸镁0.2 g/L,硫酸锰0.1 g/L,磷酸二氢钾0.5 g/L,磷酸氢二钠1.0 g/L,pH7.0;

其中,芽孢固体发酵培养基:香蕉茎叶渣60%,麸皮35%,棉粕2%,石粉1%,粗玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤三,普纳链霉菌菌粉的制备

取出普纳链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为普纳链霉菌种子液;

发酵:将上述制备的普纳链霉菌种子液以5%的接种量接种至灭菌的普纳链霉菌固体发酵培养基上,菌种与普纳链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的普纳链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-8cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵4-6天,检测其孢子含量不低于10亿CFU/g,即可低温风干,即得到普纳链霉菌菌粉;

其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0.5克,硫酸镁:0.5克,氯化钠:0.5克,硫酸亚铁:0.01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7.2~7.4;

其中,所述的普纳链霉菌固体发酵培养基:香蕉茎叶渣80%,棉粕2%,玉米粉1%,石粉10%,麸皮7%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤四 将复合曲霉菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、普纳链霉菌菌粉与棉粕粉以1:1:1:1的比例混合均匀,检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g,木质素过氧化物酶活不低于40U/ g;锰依赖过氧化物酶活不低于100U/ g;纤维素酶含量不低于100IU/ g,木聚糖酶含量不低200IU/ g,解淀粉芽孢含量不低于20亿CFU/g,普纳链霉菌含量不低于2亿CFU/g,即可包装成品。

2.根据权利要求1所述的一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂,其特征在于,所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂的使用方法为将1-5kg腐熟菌剂稀释100倍均匀喷施至1亩香蕉茎叶残体上即可。

3.根据权利要求1所述的一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂,其特征在于,所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂的使用方法为每亩将2-10kg腐熟菌剂全地均匀撒到香蕉茎叶残体上即可。

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