本发明专利涉及一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂及其制备方法，属于农业微生物应用技术领域。
背景技术：
由于香蕉具有速生和生物量高等特点，在生产香蕉的同时也产生近乎等量的香蕉茎叶副产品，据估算，每生产1hm2香蕉可产生600-900吨茎秆，其资源非常丰富。而香蕉茎叶做为一种特殊的农业废弃物，与其它农作物秸秆相比，含有丰富的营养成分，香蕉茎叶中的碳水化合物含量高，另据报道，每株香蕉残存于假茎、叶片、球茎和根系中的氮素平均为57克，磷素为6.6克，钾素232克，如果平均利用率分别按22%、4%和46.22%计，茎叶还田的利用率按30%计，那么每公顷香蕉茎叶还田的氨、磷、钾含量分别相当于1.29吨、0.8吨、0.75吨复合肥（含量3个15%）。目前广东省大部分香蕉种植区，香蕉茎叶往往被丢弃田头或河流，不仅造成茎叶中养分资源的浪费，而且染病香蕉残体中的病菌通过水系流动而更易造成病菌的传播。由此可见，进行香蕉废弃茎叶资源的再利用研究，有着广阔的发展与应用空间，对香蕉产业的可持续发展也有着重要的现实意义。
香蕉茎叶中含有丰富的营养成分，而目前对香蕉废弃茎中的利用率极低，主要原因是其体积大，搬移困难，纤维素含量高，难以在短时间内分解，因此大部分作为废弃物被丢弃，不仅造成极大的资源浪费，而且污染环境，也给随后的蕉田管理带来很多麻烦。
为了不使得香蕉茎叶浪费，我国科研工作者也作了较多的研究，匡石滋等在专利号2010102334329中公开了一种利用香蕉茎叶进行生物发酵制作生物有机肥的方法：将砍倒的蕉杆轴向剖成两半，让其自然干燥5-7天，用粉碎机或铡草机将蕉杆粉碎成长度为2-3厘米的短节，加入鸡粪与生物发酵菌剂，混合搅匀，堆砌保持25-30天，进行发酵而成。此方法确实提升了香蕉茎叶的利用率，但其生产工作量是比较庞大的，香蕉茎叶的运输也要较多的人工；陈仁杰等在专利号201310609319X中公开了一种利用香蕉茎叶制作肉牛生物饲料的方法：其将香蕉茎叶粉碎后，配入辅料后，还要用高压蒸汽进行了灭菌处理，能源消耗较大
韩丽娜等在专利号201110272946X中公开了一种香蕉茎秆有机肥及其制备方法：主要是将香蕉茎秆作为有机质与粪肥进行发酵的方法。何寒等在专利号2012100551946中公开了一种利用香蕉秆、茎叶制作生物有机肥的方法：以香蕉秆、茎叶为主工原料，用动物粪便、塘泥为了辅料，用多级扩大的EM菌种发酵而成。这些发酵方法是传统的有机肥的发酵方法，其发酵高温会抑制或杀灭病原菌的。
但现有的利用香蕉茎叶的方法基本上是异位（不是在原种植地进行）处理的，也没有从根本上解决其搬移的问题，而且在运输过程中也会导致一些植株的病原菌（如枯萎病）的扩散而导致其他种植地病害的发生。因此，如果要在原位进行就地腐熟就一定要解决两个问题：一是快速将香蕉茎叶中的纤维的降解；二是香蕉茎叶中的病原菌的抑制或杀灭的问题。
针对以上问题，本发明采用具有高效降解香蕉茎叶能力的微生物菌株和高效抑制香蕉枯萎病的生物防治菌株制作腐熟剂，该腐熟剂在分解香蕉茎叶的过程中可以繁殖大量的生物防治菌株，有效的抑制土传病原菌的萌发。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明公开了一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂，本腐熟菌剂由具有较强纤维素，木质素，半纤维素分解功能的污色原毛平革菌，桔绿木霉，米曲霉，和具有生物防治功能解淀粉芽孢杆菌，普纳链霉菌复合发酵制成。该腐熟菌剂能够有效地加速还田香蕉茎叶残体的腐烂速度，同时能够抑制香蕉枯萎病等病原菌的生长。田间施用该腐熟菌剂后香蕉茎叶残体分解速度加快，其中香蕉茎叶残体失重率显著增加、香蕉茎叶残体拉力显著降低；土壤病原菌拮抗芽孢杆菌与放线菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低。
为了达到上述目的，本发明公开了一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂的制备方法，其具体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，复合曲霉菌粉的制备
A、污色原毛平革菌种子液的制备：取出污色原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为污色原毛平革菌种子液；
B、桔绿木霉种子液的制备：取出桔绿木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为桔绿木霉种子液；
C、米曲霉种子液的制备：取出米曲霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养5天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米曲霉种子液；
D、混合发酵：将上述制备的污色原毛平革菌种子液、桔绿木霉种子液与米曲霉种子液以2：1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的曲霉固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的曲霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵6-10天，检测其总孢子含量不低于20亿CFU/g，检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于10亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活不低于200U/ g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活不低于500U/ g；纤维素酶含量不低于500IU/ g，木聚糖酶含量不低1000IU/ g，即可低温风干，水分含量低于10%，即得到复合曲霉菌粉；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的曲霉固体发酵培养基：香蕉茎叶渣85%，棉粕2%，玉米芯8%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤二、解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备
取出解淀粉芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体种子；
发酵：将上述制备的芽孢杆菌液体种子加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵36-48小时，待芽孢含量不低于100亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到解淀粉芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁固体培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；
其中，所述液体种子培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉10 g/L， 豆粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钠1.0 g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
其中，芽孢固体发酵培养基：香蕉茎叶渣60%，麸皮35%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤三，普纳链霉菌菌粉的制备
取出普纳链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为普纳链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的普纳链霉菌种子液以5%的接种量接种至灭菌的普纳链霉菌固体发酵培养基上，菌种与普纳链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的普纳链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵4-6天，检测其孢子含量不低于10亿CFU/g，即可低温风干，即得到普纳链霉菌菌粉；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；
其中，所述的普纳链霉菌固体发酵培养基：香蕉茎叶渣80%，棉粕2%，玉米粉1%，石粉10%，麸皮7%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤四 将复合曲霉菌粉，解淀粉芽孢杆菌菌粉，普纳链霉菌菌粉与棉粕粉以1：1：1：1的比例混合均匀，检测其污色原毛平革菌孢子含量不低于2亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于40U/ g；锰依赖过氧化物酶活不低于100U/ g；纤维素酶含量不低于100IU/ g，木聚糖酶含量不低200IU/ g，解淀粉芽孢含量不低于20亿CFU/g，普纳链霉菌含量不低于2亿CFU/g，即可包装成品。
其中，所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂的使用方法为将1-5kg腐熟菌剂稀释100倍均匀喷施至1亩香蕉茎叶残体上即可；另外，也可以将2-10kg腐熟菌剂/每亩，全地均匀撒到香蕉茎叶残体上即可。
本发明的有益效果：
本发明中含有白腐真菌--污色原毛平革菌，其能产生丰富的木质素降解酶（木质素过氧化物酶；锰依赖过氧化物酶），从而快速降解香蕉茎叶残体。本发明中的腐熟菌剂主要原料就是利用香蕉茎叶残体发酵而成的，所有的菌株已经适宜在香蕉茎叶残体中快速繁殖生长，减少了各菌种由于在不同基质中而导致的不生长或繁殖慢的风险；本发明中的菌种是通过多年的筛选试验，各种菌种施入香蕉茎叶残体中后，首先由污色原毛平革菌，桔绿木霉，米曲霉产生的各类纤维素酶，木质素酶，葡聚糖酶降解香蕉茎叶残体中的纤维素，木质素等碳水化合物成为低分子糖类，供解淀粉芽孢杆菌，普纳链霉菌利用生长，并且产生大量拮抗物质，从而抑制或杀灭土壤中尖孢镰刀菌，并且促进有益菌的生长繁殖。
该腐熟菌剂中的5株菌都能在香蕉茎叶残体中共生共存的，能够有效地加速还田香蕉茎叶残体的腐烂速度，同时能够抑制香蕉枯萎病等病原菌的生长。田间施用该腐熟菌剂后香蕉茎叶残体分解速度加快，其中香蕉茎叶残体失重率显著增加、香蕉茎叶残体拉力显著降低;土壤病原菌拮抗芽抱杆菌与放线菌数量显著增加，病原性微生物数量显著降低。
本发明产品与市场产品比较具有以下优点：施用后土壤中尖孢镰刀菌数量只有施用常规市售腐熟剂处理的10%-20%。施用该腐熟剂后，土壤中抑制尖孢镰刀菌的芽孢杆菌数量较施用常规腐熟剂处理增加1000-10000倍；土壤中抑制尖孢镰刀菌的放线菌数量较施用常规腐熟剂处理增加了100-1000倍。
具体实施方式
实施例1
一种抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟菌剂，其特征在于，所述抑制枯萎病的香蕉茎叶残体腐熟剂主要由以下几种菌：污色原毛平革菌，桔绿木霉，米曲霉，解淀粉芽孢杆菌，普纳链霉菌发酵制成；其具体的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，复合曲霉菌粉的制备
A、污色原毛平革菌种子液的制备：取出污色原毛平革菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.01亿cfu/ml，即为污色原毛平革菌种子液；
B、桔绿木霉种子液的制备：取出桔绿木霉菌菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养6天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养4-6天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为桔绿木霉种子液；
C、米曲霉种子液的制备：取出米曲霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养5天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养5-7天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为1亿cfu/ml，即为米曲霉种子液；
D、混合发酵：将上述制备的污色原毛平革菌种子液、桔绿木霉种子液与米曲霉种子液以2：1：1的比例混合均匀后，以2%的接种量接种至灭菌的曲霉固体发酵培养基上，菌种与固体培养基混合均匀后，将接好种的曲霉固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-10cm，控温28-32℃，湿度保持为60%-75%，发酵8天，检测其总孢子含量为30亿CFU/g，检测其污色原毛平革菌孢子含量为13亿CFU/g，木质素过氧化物酶活，即LiP酶活为265U/ g；锰依赖过氧化物酶，即MnP酶活为621U/ g；纤维素酶含量为788IU/ g，木聚糖酶含量为1508IU/ g，即可低温风干，水分含量低于10%，即得到复合曲霉菌粉；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的曲霉固体发酵培养基：香蕉茎叶渣85%，棉粕2%，玉米芯8%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤二、解淀粉芽孢杆菌菌粉的制备
取出解淀粉芽孢杆菌保藏管，用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前10小时通气量为200L/min，10小时后通气量为320L/min ，30℃培养16-24小时，待总菌含量不低于20亿cfu/ml，即可作为芽孢杆菌液体种子；
发酵：将上述制备的芽孢杆菌液体种子加至芽孢固体发酵培养基中，混匀，在浅盘上发酵，堆料厚度为5-10cm，控制发酵温度为30-40℃，发酵44小时，检测芽孢含量为150亿cfu/g，即可晒干，待水分含量低于10%，即得到解淀粉芽孢杆菌菌粉；
其中，所述营养肉汁固体培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂20 g，水1000mL，pH7.2；
其中，所述液体种子培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉10 g/L， 豆粉10 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，磷酸氢二钠1.0 g/L，pH7.0；
其中，芽孢固体发酵培养基：香蕉茎叶渣60%，麸皮35%，棉粕2%，石粉1%，粗玉米皮2%，尿素0.4%，磷酸氢二钾0.4%，硫酸镁0.05%，培养基含水量50%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤三，普纳链霉菌菌粉的制备
取出普纳链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为普纳链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的普纳链霉菌种子液以5%的接种量接种至灭菌的普纳链霉菌固体发酵培养基上，菌种与普纳链霉菌固体培养基混合均匀后，将接好种的普纳链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上，物料高度为5-8cm，控温28-32℃，前两天空气湿度保持为60%-75%，过后空气湿度保持为40%-50%，发酵5天，检测其孢子含量为18亿CFU/g，即可低温风干，即得到普纳链霉菌菌粉；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒2～7﹒4；
其中，所述的普纳链霉菌固体发酵培养基：香蕉茎叶渣80%，棉粕2%，玉米粉1%，石粉10%，麸皮7%，硫酸锰0.004%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，固体培养基含水量为40%-60%；各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
步骤四 将复合曲霉菌粉、解淀粉芽孢杆菌菌粉、普纳链霉菌菌粉与棉粕粉以1：1：1：1的比例混合均匀，检测其污色原毛平革菌孢子含量为3亿CFU/g，木质素过氧化物酶活不低于55U/ g；锰依赖过氧化物酶活不低于120U/ g；纤维素酶含量不低于150IU/ g，木聚糖酶含量不低310IU/ g，解淀粉芽孢含量不低于31亿CFU/g，普纳链霉菌含量不低于3亿CFU/g，即可包装成品。
实施例2
腐熟菌剂应用试验腐熟菌剂加速香蕉茎叶残体腐熟和抑制枯萎菌病害效果验证:
试验基地：徐闻县龙塘镇某大型种植户；
设置如下处理:处理1.对照，土壤不施用任何腐熟剂，用等量的清水喷施在粉碎的香蕉茎叶残体；处理2.施用市场上销售腐熟剂5kg/亩，稀释100倍喷施在粉碎的香蕉茎叶残体；处理3.施用本发明腐熟剂2kg/亩，稀释100倍喷施在粉碎的香蕉茎叶残体。每处理小区面积10亩。实验测定香蕉茎叶拉力变化与失重率的变化，土壤尖孢镰刀菌(容易引起香蕉枯萎病)数量，土壤中抑制尖孢镰刀菌的芽孢杆菌数量。
实验结果表明：实验开始后第15天、35天和60天，相较于对照处理，施用本发明腐熟菌剂的处理香蕉茎叶拉力显著降低；而且施用本发明腐熟菌剂处理的香蕉茎叶拉力比市售腐熟剂处理香蕉茎叶的拉力降低25% -56%。香蕉茎叶的失重率测定显示，施用本发明腐熟菌剂处理的香蕉茎叶失重率显著高于对照处理，香蕉茎叶失重率增加2. 1-3. 2倍；本发明处理香蕉茎叶失重率也高于市售腐熟剂处理的香蕉茎叶。试验结束后土壤微生物测定显示，施用本发明处理土壤中尖孢镰刀菌数量显著地低于对照处理，不到对照处理的1%；本发明处理土壤尖孢镰刀菌数量也显著地低于市售腐熟剂处理，只有对照处理的10%，市售秸秆腐熟剂对土壤病原性真菌没有很好的抑制效果。土壤中可以抑制病原菌的芽孢杆菌数量测定显示，市售秸秆腐熟剂处理和对照处理没有显著差别，但是本发明处理土壤抑制病原菌的芽孢杆菌数量比对照处理高约1000-10000倍。土壤中抑制尖孢镰刀菌的放线菌数量较施用常规腐熟剂处理增加了100-1000倍。