早期监测肿瘤放疗导致的放射性肺炎纤维化的方法与流程

本发明涉及一种用于早期监测肿瘤放疗导致的放射性肺炎纤维化的方法，具体涉及一种分子标记物用于放射性肺炎早期诊断与预后评估的方法。

背景技术：

放射性肺炎(radiation pneumonitis，RP)，是多种恶性肿瘤(包括肺癌、乳腺癌和食管癌)经放射治疗后肺组织出现异常的病理表现,属于常见的并发症，可分为急性放射性炎症改变和慢性纤维化病变。轻者无明显症状,重者可引起肺广泛纤维化,呼吸功能障碍,甚至呼吸衰竭，也是放射性肺损伤的主要致死原因。目前对于放射性肺炎的对策主要是早期预防与早期发现，但对于检测放射性肺炎发生发展的监测指标甚少，另外临床上对放射性肺炎尚没有令人满意的治疗措施，同时限制了肿瘤放疗的剂量,肺功能状态直接关系到肿瘤患者的治疗效果和生活质量。因此，预测并减少放射性肺炎的发生是胸部癌症放射治疗策略的重要组成部分。

目前，放射性肺炎的发病机制尚未完全明了，虽然已经发现一些指标与放射性肺炎具有相关性，但其有意义的诊断阈值未确定。所以，为了降低放射性肺炎的发生率和严重程度，需要深入研究其发生的分子机制，筛选特异性和敏感性都适宜的临床预测指标，进一步改进放射治疗技术，以及根据患者病情，考虑各种可能因素，区别对待，制订合理治疗计划，尽量减少放射性肺炎的发生。放射性肺炎一旦发生，往往不可逆转，因此其预防的意义比治疗更为重要。

如果患者一年内肺部接受过放疗，逐渐出现持续2周以上咳嗽、呼吸困难等肺部症状，同时肺部影像学显示与照射视野一致的片状或条索状阴影就要考虑并发放射性肺炎的可能，尽管是非感染性的,也要与感染性肺炎进行鉴别，并且放射性肺炎发生之后常常合并感染。临床上两者的鉴别要点主要从放射治疗史、影像学以及感染性指标(如血常规，痰培养等)入手。

S100A8和S100A9是钙结合蛋白家族成员，两者不仅以单体的形式存在，而且多以异二聚体的结构来发挥作用，因此常常被人们同时选择进行比较研究。它们主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞和某些角化细胞，具有强大的抗菌特性，因此被称为“钙卫蛋白”。研究表明，体内应激状态下，活化的中性粒细胞、巨噬细胞能稳定分泌S100A8和S100A9，而两者又能招募和激活更多的炎性细胞，从而形成正反馈效应。巨噬细胞是肺脏的重要细胞，在慢性炎症环境中能够被多种黏附分子和趋化因子招募聚集并释放炎性介质，与放射性肺炎的发生密切相关。有研究显示体外培养的细胞系在X线的照射下能够诱导S100A8和S100A9的表达，其机制可能与电离辐射模拟炎症因子效应促进巨噬细胞激活有关。在某些炎症参与的病理过程中，S100A8和S100A9是被公认的促炎性反应的效应器或放大器。因此，两者已被用作监测炎症病情发展和评价治疗效果的生物标记物。

近年来，越来越多的研究发现S100A8和S100A9与许多种疾病相关，例如两者分别在肿瘤及炎症组织中呈高表达，在急性与慢性炎症中扮演重要角色，对研究多种疾病发生、发展、治疗及预后均有指导意义，有望成为检测相关疾病的的新指标。前期研究基础发现，在小鼠眼部建立的炎症模型中，我们发现S100A8和S100A9的表达在基因和蛋白水平都明显的升高。目前尚无其应用于放射性肺炎早期诊断与预后的报道。

技术实现要素：

本发明的目的为设计一种可以在全血中检测放射性肺炎敏感的预警指标，涉及了两种炎性因子S100A8和S100A9用于早期监测肿瘤放疗导致的放射性肺炎的方法，关键点为人的S100A8和S100A9引物的设计。明确了外周血中S100A8和S100A9在不同恶性肿瘤(包括肺癌、乳腺癌和食管癌)经放疗后并发放射性肺炎的患者中表达明显增加，与无并发症患者有显著统计学差异。其中S100A8表达的高低与放射性肺炎患者预后，包括肺部炎症反应、纤维化及肺功能的改变具有相关性，提示高表达S100A8的放射性肺炎患者预后较差，具有早期预警放射性肺炎的发生和评估其预后的应用价值。具有早期监测放射性肺炎的发生，并且能够评估疾病预后的特点，其操作具有简单、灵敏性和特异性高的优点。

为实现上述目的，本发明采用一种早期监测肿瘤放疗导致的放射性肺炎纤维化的方法，通过人的S100A8和S100A9引物和抗体的设计，早期监测放射性肺炎和肺纤维化的发生，并且评估疾病预后。

包括以下步骤：

(1)确定目标检测对象，排除Ⅳ期广泛转移者，行肺部手术者，有哮喘、严重慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、严重肺部感染者或有其他严重疾病者；

(2)提取患者外周血的基因组，用实时定量PCR方法检测S100A8和S100A9在基因水平的变化范围，留取样本时间点分别是放疗前、放疗1周、2周、3周、放疗后1个月、2个月、3个月；

(3)分析目的基因的表达量差异；

(4)根据结果和感染性肺炎排除检测评估监测早期放射性肺炎和肺纤维化。

进一步的，所述步骤(1)中目标检测对象为恶性肿瘤并接受三维适形放射治疗的患者。

进一步的，所述步骤(2)的检测步骤为：

清晨空腹静脉采血5ml于血常规管内，裂解红细胞后经0.9％NaCl溶液对倍稀释后，缓缓加入到装有等体积Ficoll 100溶液的离心管中，2500rpm转速离心10分钟，吸取中间单个核细胞层置于1.5ml EP管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀为外周血单个核细胞；

在每份外周血单个核细胞中加入1ml Trizol溶液，振荡混匀，加入200氯仿，颠倒混匀数次，13000rpm离心15分钟，上层水相转移到另一EP管中，加入等体积异丙醇溶液，室温静置5分钟，13000rpm离心15分钟，弃上清，加入500μl 70％乙醇洗涤两次，真空干燥，沉淀溶解在20μl TE溶液中；

将每个样本的1ug RNA在20ul的体系中逆转录成cDNA，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以GAPDH基因做为内对照，反应体系是25ul,反应程序：预变性95℃，10min；循环95℃，15sec,60℃,1min,共40个循环。

进一步的，所述人S100A8cDNA序列：

ATGTTGACCGAGCTGGAGAAAGCCTTGAACTCTATCATCGACGTCTACCACAAGTACTCC

CTGATAAAGGGGAATTTCCATGCCGTCTACAGGGATGACCTGAAGAAATTGCTAGAGACC

GAGTGTCCTCAGTATATCAGGAAAAAGGGTGCAGACGTCTGGTTCAAAGAGTTGGATATC

AACACTGATGGTGCAGTTAACTTCCAGGAGTTCCTCATTCTGGTGATAAAGATGGGCGTG

GCAGCCCACAAAAAAAGCCATGAAGAAAGCCACAAAGAGTAG

引物序列：

product length＝235

Forward primer：CGAGCTGGAGAAAGCCTTGA 20

Reverse primer：TGCCACGCCCATCTTTATCA 20

人S100A9：

cDNA序列：

ATGACTTGCAAAATGTCGCAGCTGGAACGCAACATAGAGACCATCATCAACACCTTCCAC

CAATACTCTGTGAAGCTGGGGCACCCAGACACCCTGAACCAGGGGGAATTCAAAGAGCTG

GTGCGAAAAGATCTGCAAAATTTTCTCAAGAAGGAGAATAAGAATGAAAAGGTCATAGAA

CACATCATGGAGGACCTGGACACAAATGCAGACAAGCAGCTGAGCTTCGAGGAGTTCATC

ATGCTGATGGCGAGGCTAACCTGGGCCTCCCACGAGAAGATGCACGAGGGTGACGAGGGC

CCTGGCCACCACCATAAGCCAGGCCTCGGGGAGGGCACCCCCTAA

引物序列：

product length＝178

Forward primer：GCTGGTGCGAAAAGATCTGC 20

Reverse primer：GTCACCCTCGTGCATCTTCT 20

人GAPDH:

cDNA序列：

ATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAGG

GCTGCTTTTAACTCTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTGACCTC

AACTACATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTC

AAGGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAGCGA

GATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGC

GTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGCAGGGGGGAGCCAAAAGGGTCATC

ATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT

GACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCCCTG

GCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCC

ATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGC

GGGGCTCTCCAGAACATCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTC

ATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTG

TCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCTGCCAAATATGATGACATCAAGAAG

GTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAG

GTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGCTGGC

ATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTAC

AGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAA

引物序列：

Forward primer：CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT 24

Reverse primer：AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 24。

进一步的，所述步骤(3)基因相对表达量计算公式为2-△△ct,分析目的基因的表达量差异。

进一步的，所述感染性肺炎排除检测为血常规检查、痰培养或影像学检查的一种或几种结合；

其中，血常规检测的具体步骤如下：患者静脉采血约5mL，通过血液细胞分析仪检测各类细胞和成份的变化。重点分析结果中中性粒细胞和淋巴细胞计数以及比例。如果白细胞总数超过10×10⁹个/L，中性粒细胞百分比超过70％，则提示为细菌性肺炎；如果淋巴细胞计数或比例升高，则多考虑为病毒性肺炎。单纯放射性肺炎患者的白细胞或淋巴细胞比例和计数常常低于正常值。

痰培养检测的具体步骤如下：留取标本时一般以晨痰为佳，直接涂片，光镜下观察细胞数量，每低倍视野鳞状上皮细胞<10个，白细胞>25个，或鳞状上皮细胞/白细胞<1：2.5，可作为“合格”标本继续进行接种培养。如果连续二次分离到相同细菌，浓度10⁵-10⁶CFU/ml，可认为是肺炎感染的致病菌。单纯放射性肺炎患者的痰培养往往呈阴性。

影像学检查的具体步骤如下：胸部CT扫描，特别是高分辨断层摄影术能发现更隐匿的病灶和特征性改变，对感染和非感染性疾病的鉴别、特殊感染的诊断都具有很高的实用价值。在应用中需重点分析实变影、结节影、空洞影、弥漫性肺泡渗出影的鉴别诊断。实变影多是细菌或真菌感染的征象。如果患者一年内肺部接受过放疗，肺部影像学显示与照射视野一致的片状或条索状阴影就要考虑并发放射性肺炎的可能。

本发明的有益效果在于：

(1)研究发现S100A8和S100A9可以应用于放射性肺炎和肺纤维化的早期诊断与预后；

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是MCP-1细胞经放射线照射后S100A8mRNA的表达水平；

图2是MCP-1细胞经放射线照射后S100A9mRNA的表达水平；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种早期监测肿瘤放疗导致的放射性肺炎纤维化的方法，通过人的S100A8和S100A9引物和抗体的设计，早期监测放射性肺炎和肺纤维化的发生，并且评估疾病预后。

包括以下步骤：

(1)确定目标检测对象，排除Ⅳ期广泛转移者，行肺部手术者，有哮喘、严重慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、严重肺部感染者或有其他严重疾病者；

(2)提取患者外周血的基因组，用实时定量PCR方法检测S100A8和S100A9在基因水平的变化范围，留取样本时间点分别是放疗前、放疗1周、2周、3周、放疗后1个月、2个月、3个月；

(3)分析目的基因的表达量差异；

(4)根据结果和感染性肺炎排除检测评估监测早期放射性肺炎和肺纤维化。

感染性肺炎：是指由细菌、病毒、支原体等致病微生物引起的肺部炎症。通常以抗生素、抗病毒治疗为主。

非感染性肺炎：是由放射线、吸入性异物或机械性损伤引起的肺部炎症。针对病因对症治疗。放射性肺炎属于非感染性肺炎。

本研究是对于特定的人群(进行胸部放射治疗的肿瘤患者)进行早期检测，预防常见并发症放射性肺炎的发生，指导临床医生及时调整治疗方案与剂量，避免不适宜的治疗带给患者的损伤。

本发明建议除了明确的放射治疗史外，最好结合以下检测手段鉴别放射性肺炎与感染性肺炎，做出合理的诊断。

1.血常规检查

患者静脉采血约5mL，通过血液细胞分析仪检测各类细胞和成份的变化。重点分析结果中中性粒细胞和淋巴细胞计数以及比例。如果白细胞总数超过10×10⁹个/L，中性粒细胞百分比超过70％，则提示为细菌性肺炎；如果淋巴细胞计数或比例升高，则多考虑为病毒性肺炎。单纯放射性肺炎患者的白细胞或淋巴细胞比例和计数常常低于正常值。

2.痰培养

留取标本时一般以晨痰为佳，直接涂片，光镜下观察细胞数量，每低倍视野鳞状上皮细胞<10个，白细胞>25个，或鳞状上皮细胞/白细胞<1：2.5，可作为“合格”标本继续进行接种培养。如果连续二次分离到相同细菌，浓度10⁵-10⁶CFU/ml，可认为是肺炎感染的致病菌。单纯放射性肺炎患者的痰培养往往呈阴性。

3.影像学检查

胸部CT扫描，特别是高分辨断层摄影术能发现更隐匿的病灶和特征性改变，对感染和非感染性疾病的鉴别、特殊感染的诊断都具有很高的实用价值。在应用中需重点分析实变影、结节影、空洞影、弥漫性肺泡渗出影的鉴别诊断。实变影多是细菌或真菌感染的征象。如果患者一年内肺部接受过放疗，肺部影像学显示与照射视野一致的片状或条索状阴影就要考虑并发放射性肺炎的可能。

实验结果验证：

(一)基础实验：

人巨噬细胞MCP-1细胞系于含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640培养液，37℃，5％CO2饱和度条件下培养。对数增殖期细胞照射前24h，换新鲜培养基，60Coγ射线照射，吸收剂量10Gy，照射后24h，加入脂多糖LPS至终浓度5ug/ml，继续培养24h。

以RT-PCR方法检测人巨噬细胞MCP-1细胞系受电离辐射后胞内S100A8和S100A9mRNA表达水平的改变，可见MCP-1细胞单纯受10Gy 60Coγ射线照射后48h或5ug/mL LPS培养24h，S100A8mRNA表达增强；但10Gy 60Coγ射线照射后24h加入5ug/mL LPS继续培养24h，S100A8和S100A9mRNA表达明显增强(见图1、图2)，说明γ射线与LPS协同增强巨噬细胞MCP-1中S100A8和S100A9mRNA的表达。

(二)临床实验：

1、研究对象的纳入标准：在我院经病理学证实为恶性肿瘤并接受三维适形放射治疗，临床诊断并发放射性肺炎的患者共67例，其中肺癌34例，乳腺癌22例，食管癌11例，预计生存≥6个月，KPS评分≥80分，签订知情同意书。

排除标准：Ⅳ期广泛转移者，行肺部手术者，有哮喘、严重慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、严重肺部感染者或有其他严重疾病。年龄(59±13)岁；女39例，男28例。其中有23例发生了放射性肺炎，为肺癌13例，乳腺癌7例，食管癌3例，发病在放疗后2-5个月，平均为(3.2±1.2)个月，均符合放射性肺炎的诊断标准。

2、诊断标准：按美国肿瘤放射治疗协作组(RTOG)急性和晚期肺放射损伤分级标准评价，有肺炎症状与体征，特别是胸部CT显示与射野区域一致的弥漫性片状密度升高影，诊断为放射性肺炎。因≥2级放射性肺炎即发生持续性咳嗽和(或)呼吸困难，需进行临床处理，故选择观察终点为≥2级放射性肺炎。根据是否发生放射性肺炎将60例患者分为放射性肺炎组(23例)和无放射性肺炎组(44例)。

3、治疗方案：

采用IMRT，胸腹体膜固定，CT模拟扫描，扫描层间距5mm；在Varian Eclipse DX计划系统勾画靶区，根据ICRU50、62号报告对靶区和肺、食管、心脏、脊髓等重要器官进行勾画。肿瘤靶区(GTV)为CT上可见肿瘤(包括肺内病灶和纵隔淋巴结)；临床靶区(CTV)为GTV外扩6-8mm，支气管方向外放12mm，包括部分淋巴引流区；计划靶区为相应的CTV外扩5-10mm(综合考虑呼吸运动幅度和摆位误差等因素确定)；利用射野方向观(beam eye view)功能设计4-6个照射野，应用DVH和等剂量曲线，结合患者肺功能状态和危及器官受量综合评价确定治疗计划；放疗剂量为2Gy/次，5次/周，60-70Gy；收集GTV的平均剂量、最大剂量、最小剂量，肺脏V5、V10、V20平均剂量、正常组织并发症概率(NTCP)，食管V45，心脏平均受照剂量和脊髓最大受照剂量共11个物理参数资料。

4、检测步骤：提取患者外周血的基因组，用实时定量PCR方法(RT-PCR)检测S100A8和S100A9在基因水平的变化范围，留取样本时间点分别是放疗前、放疗1周、2周、3周、放疗后1个月、2个月、3个月。清晨空腹静脉采血5ml于血常规管内，裂解红细胞后经0.9％NaCl溶液对倍稀释后，缓缓加入到装有等体积Ficoll 100溶液的离心管中，2500rpm转速离心10分钟，吸取中间单个核细胞层置于1.5ml EP管中，5000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀为外周血单个核细胞。在每份外周血单个核细胞中加入1ml Trizol溶液，振荡混匀，加入200氯仿，颠倒混匀数次，13000rpm离心15分钟，上层水相转移到另一EP管中，加入等体积异丙醇溶液，室温静置5分钟，13000rpm离心15分钟，弃上清，加入500μl 70％乙醇洗涤两次，真空干燥，沉淀溶解在20μl TE溶液中。将每个样本的1ug RNA在20ul的体系中逆转录成cDNA，以cDNA为模板，扩增目的基因S100A8和S100A9，以GAPDH基因做为内对照，反应体系是25ul,反应程序：预变性95℃，10min；循环95℃，15sec,60℃,1min,共40个循环，基因相对表达量计算公式：2-△△ct,分析目的基因的表达量差异。

表1两组患者于放疗前、中、后S100A8mRNA水平测定结果比较

表2两组患者于放疗前、中、后S100A9mRNA水平测定结果比较

在放疗前，放射性肺炎组与无放射性肺炎组外周血中S100A8和S100A9mRNA水平差异无统计学意义；放疗过程中，放射性肺炎组S100A8和S100A9mRNA水平逐渐升高，无放射性肺炎组S100A8和S100A9mRNA水平升高趋势不明显；放射性肺炎组患者在放疗前、中、后各个时间点血中S100A8和S100A9mRNA水平均高于无放射性肺炎组(P<0.05)，见表1、表2。

全组患者最短随访时间为3个月，最长随访时问为12.5个月，中位随访时间为6个月，无失访病例。随访期间急性RP总发生率34％(23/67)，2级及2级以上放射性肺损伤发生率为30.4％(7/23)。应用统计学软件SPSS 22.0,根据S100A8和S100A9表达水平与肺部纤维化的发生率通过Pearson检验分析，发现S100A8的表达水平与肺部纤维化的发生呈显著正相关(P＜0.05),S100A9的表达水平与肺部纤维化的发生相关性不明显。