一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物医学
技术领域：
，具体地说就是一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测方法及试剂盒，尤其是一种细胞因子信号转导抑制因子1作为检测肝衰竭预后的标志物实现糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测法及试剂盒。
背景技术：
：肝衰竭是严重的终末期肝脏疾病，是以黄疸、凝血功能障碍、肝性脑病及腹水等为主要表现，最终导致多器官功能障碍的一组临床症候群，病情凶险，临床预后不佳，我国是HBV高流行率国家，部分慢性HBV感染患者在合并其他病毒感染、酒精性或药物性肝损害等促发因素作用下，病情迅速恶化，进展为慢加急性肝衰竭，被称为慢加急性乙型肝炎肝衰竭（acute-on-chronichepatitisBliverfailure,ACHBLF），乙型肝炎重症化由多基因、多因素所致，其发病机制非常复杂。在肝衰竭发生过程中,肝脏组织依次经受了原发性免疫损伤、组织缺血缺氧和内毒素血症三重打击，在免疫损伤和炎症反应的过程中,细胞因子大量激活并介导肝脏损伤,各种细胞因子共同参与并相互影响,形成一个复杂而庞大的网络系统，ACHBLF约占肝衰竭所有病因的80%，病死率高达60%-80%，其临床救治是医学难题，临床上急需有效评估病情、判断疗效和预测预后的体系。先前的研究证实肝衰竭的发病与免疫介导的肝脏损伤和免疫功能过度增强有关，肝衰竭的发病由于细胞毒Ｔ细胞攻击肝细胞，导致肝细胞凋亡、溶解，继之引起机体强烈的细胞免疫反应，内毒素、细胞因子、氧自由基等使肝窦内皮细胞损伤、肝内微循环障碍、大量肝细胞缺血缺氧坏死，一般认为,一旦患者出现肝功能衰竭早期表现，如果尽早干预，减轻炎症损伤，积极纠正免疫衰竭，有效控制病情进展，慢加急性肝衰竭患者肝功能是可逆转甚至能够恢复到恶化前的状态，对降低患者死亡率有重要的意义，糖皮质激素是发挥抗炎和免疫抑制作用的重要调节剂，可通过抑制细胞毒性T细胞等淋巴细胞的免疫应答，延缓或阻止过强的细胞免疫所致的组织损伤，同时能抑制多种炎症因子的合成及释放，阻止或延缓过强细胞免疫所致的原发性肝损伤，此外糖皮质激素还可以稳定溶酶体膜及细胞膜，防止肝细胞崩解坏死，保护肝细胞，阻止或延缓继发性肝脏损害，发挥抗内毒素血症的作用，近来研究证明，虽然肝衰竭患者在应激状态下激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，但患者普遍存在肾上腺皮质储备能力不足，肾上腺皮质功能不全的表现，同时，糖皮质激素对于免疫性肝炎及酒精性肝炎引起的肝衰竭疗效已得到肯定。因此在ACHBLF患者应用糖皮质激素抑制过度免疫应答并阻止被感染的肝细胞裂解或许是个合理的治疗策略，然而，有些反对者认为只有部分患者接受糖皮质激素治疗获得了满意的临床疗效，其应用可能会发生严重并发症及停药后病情反弹，对于激素治疗适应症的掌握仍缺乏有效评估手段。表观遗传学是目前生命科学的研究前沿，研究表明，表观遗传在肝衰竭的发生发展中发挥重要作用，DNA甲基化是表观遗传学的重要调控机制之一，它是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移至胞嘧啶的5-碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，而甲基化则主要发生于CpG岛的胞嘧啶上，CpG岛的甲基化可使基因沉默、失活，影响基因转录，调控基因表达，而非甲基化则与基因活化密切相关，研究证实，感染HBV的宿主均存在DNMT表达上调的现象，因此，HBV可通过增强DNMT的活性，促使特异基因发生甲基化，调节靶基因的表达，这是HBV感染重症化过程中的频发事件，也是加重肝衰竭患者肝脏炎症损害的重要原因，因此，特异基因的甲基化可作为判断肝衰竭预后和治疗疗效的分子标志物，具有重要意义。细胞因子信号传导抑制分子1(Suppressorofcytokinesignaling1,SOCS1)是由细胞因子诱导产生的负调控因子，通过调节IRF-1信号通路及JAK/STAT信号通路，对非特异性免疫和特异性免疫发挥重要的抑制作用，已有研究表明，HBV相关性肝纤维化及肝癌中存在SOCS1基因启动子的超甲基化，我们研究发现，ACHBLF患者中也存在SOCS1基因启动子区的甲基化，SOCS1基因甲基化导致的表达水平降低可能是ACHBLF患者炎症因子水平升高，肝脏损伤加重的原因之一，糖皮质激素可以引起基因的去甲基化效应，有研究报道使用激素处理动物肝脏后，SOCS1mRNA表达量明显上升，以此为基础，我们观察了肝衰竭患者SOCS1甲基化水平与应用激素治疗疗效的相关性，结果发现SOCS1高甲基化的肝衰竭患者应用糖皮质激素可获得更好的预后。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测方法及试剂盒，以解决现有技术中对糖皮质激素治疗肝衰竭适应症缺少有效的生物学分子标志物的技术问题。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测试剂盒，盒内包括对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂、5×预混PCR反应体系、针对目的基因SOCS1启动子的甲基化特异性引物对与Taqman荧光探针、针对内参基因ALU-C4的特异性引物对与Taqman荧光探针、提取外周血基因组DNA的试剂、阳性对照和阴性对照；其中，针对针对目的基因SOCS1启动子的甲基化特异性引物对与Taqman荧光探针序列为：SOCS1-上游引物：5’GCGTCGAGTTCGTGGGTATTT3’；SOCS1-下游引物：5’CCGAAACCATCTTCACGCTAA3’；SOCS1-探针:5’FamACAATTCCGCTAACGACTATCGCGCA3’TAMRA；针对内参基因ALU-C4的特异性引物对与Taqman荧光探针序列为：ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA3’；ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA3’；ALU-C4-探针:5’FamCCTACCTTAACCTCCC3’BHQ1。作为优化，阳性对照为重亚硫酸盐修饰的100%甲基化的人基因组DNA；阴性对照为高压的双蒸馏水。一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测方法，其步骤在于：（1）提取待测样本外周血基因组DNA；（2）对基因组DNA进行甲基化修饰处理；（3）分别用SOCS1启动子的甲基化特异性引物对和荧光探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针序列，对步骤（2）修饰处理过的DNA进行PCR反应,采用实时定量甲基化特异性PCR的方法，计算出目的基因SOCS1甲基化程度的定量值；（4）将步骤（3）所获得的受试者的SOCS1甲基化水平与正常人的水平相比，如果受试者SOCS1甲基化水平显著增高，则应用糖皮质激素治疗的疗效好，糖皮质激素治疗后患者预后好。作为优化，采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰处理，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板。作为优化，通过荧光PCR仪获得各PCR反应管的甲基化反应的阈值循环值，其SOCS1甲基率=100%×2exp-[ΔCp(样品SOCS1Cp值-样品ALU-C4Cp值)-ΔCp（阳性对照SOCS1Cp值-阳性对照ALU-C4Cp值）]。本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明应用率先对ACHBLF患者和健康对照者的外周血单个核细胞SOCS1基因启动子甲基化状态进行了分析，并分析肝衰竭患者SOCS1甲基化程度与患者临床指标的相关性，发现肝衰竭患者存在SOCS1基因高甲基化，并且肝衰竭死亡组患者中SOCS1基因高甲基化程度更高，与临床预后具有相关性。更重要的是，SOCS1高甲基化肝衰竭患者应用糖皮质激素治疗疗效优于低甲基化患者。在此基础上我们完成了本发明，是SOCS1基因甲基化在测糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测法及试剂盒中的应用。本发明的优点如下：1、本发明应用基于Taqman荧光探针的实时定量甲基化特异性PCR检测方法，是利用荧光标记的Taqman荧光探针追踪PCR产物，实时反映甲基化特异性PCR过程，利用相关软件对甲基化特异性PCR产物进行分析，从而得到待测样本的初始模板量，本方法可克服传统MSP-PCR定性检测的缺点，消除非特异性扩增，更好的避免DNA污染对结果的影响，确保检测结果的特异度，该检测方法能够检测到人体外周血中极微量的DNA，灵敏度高，特异性强，适用于检测DNA含量少、损失率高的标本，此外，本发明标本取自慢加急性肝衰竭患者外周血，取材方便，操作简便且病人创伤小，本发明采用试剂盒组装，相较其他检测技术，具有检测快速、结果准确、直观等优点，可作为临床医师评估慢加急性肝衰竭患者预后及指导治疗的依据。2、本发明利用肝衰竭患者SOCS1甲基化水平与患者预后及与应用激素治疗疗效的相关性，利用试剂盒和SOCS1基因的启动子甲基化的定量检测方法完成的本发明，可作为辅助慢加急性肝衰竭诊断、疗效观察、预后判断及指导治疗的有力手段，本发明利用一个试剂盒就可以做到由采血到定量检测与肝衰竭预后相关的SOCS1基因甲基化水平全过程，通过检测血液中SOCS1基因甲基化程度判断肝衰竭患者预后及疗效，具有操作简便、灵敏度高、结果准确可靠、稳定性好的优点，具有深远的临床意义，适于大规模推广应用，为临床医生快速准确掌握患者病情，及时采取更具个性化的治疗方案提供支持。附图说明图1为慢加急性肝衰竭患者、慢性乙型肝炎患者、正常对照的SOCS1基因启动子甲基化程度的比较；图中：PMR（%）为甲基化比例，ACHBLF为慢加急性肝衰竭患者，CHB为慢性乙型肝炎患者，HC为正常对照；图2为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与临床指标的相关性；图中TBIL为总胆红素，PTA为凝血酶原活动度，PT-INR为国际标准化比值，MELDscore为终末期肝病模型积分；图3为不同预后慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化程度的比较；图中GC-S为糖皮质激素治疗生存组患者，GC-NS为糖皮质激素治疗死亡组患者，CM-S为保守治疗生存组患者，CM-NS为保守治疗死亡组患者；图4为SOCS1高甲基化组与低甲基化组中慢加急性肝衰竭患者的生存曲线比较和SOCS1基因启动子甲基化定量程度用来判断慢加急性肝衰竭患者预后的受试者特征工作曲线；图中Survivalprobability为存活率，Sensitivity为敏感性，Specificity为特异性；图5为高甲基化组和低甲基化组慢加急性肝衰竭患者激素治疗组和保守治疗组慢加急性肝衰竭患者的生存曲线比较。具体实施方式为更详细地阐述本发明，下面结合附图和实施例对本发明的具体方法进一步进行阐述，仅用于解释本发明，而不能理解为发明的限制，下列实施例中未标明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件实施检测。一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测试剂盒：盒内包括对基因组DNA进行重亚硫酸盐修饰的试剂、5×预混PCR反应体系、针对目的基因SOCS1启动子的甲基化特异性引物对与Taqman荧光探针、针对内参基因ALU-C4的特异性引物对与Taqman荧光探针、提取外周血基因组DNA的试剂、阳性对照和阴性对照。本发明提供提取外周血基因组DNA的试剂，利用一个试剂盒就可以做到由采血到定量检测与肝衰竭预后相关的SOCS1基因甲基化水平全过程，通过检测血液中SOCS1基因甲基化程度判断肝衰竭患者预后及疗效。5×预混PCR反应体系为市场出售产品，其中含有热启动Taq聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、PCR反应的增强剂、优化剂以及稳定剂。本试剂盒中针对针对目的基因SOCS1启动子的甲基化特异性引物对与Taqman荧光探针序列为：SOCS1-上游引物：5’GCGTCGAGTTCGTGGGTATTT3’；SOCS1-下游引物：5’CCGAAACCATCTTCACGCTAA3’；SOCS1-探针:5’FamACAATTCCGCTAACGACTATCGCGCA3’TAMRA；针对内参基因ALU-C4的特异性引物对与Taqman荧光探针序列为：ALU-C4-上游引物：5’GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA3’；ALU-C4-下游引物：5’ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA3’；ALU-C4-探针:5’FamCCTACCTTAACCTCCC3’BHQ1。为了便于质控，本试剂盒内还设有阳性对照及阴性对照，其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得。实施例1定量检测外周血基因组DNASOCS1甲基化水平1、基因组DNA提取抽取受试者外周静脉血，可以应用硅胶膜离心柱吸附法（采用核酸纯化试剂盒，QIAampDNABloodMiniKit，货号：51104）提取基因组DNA，也可以用酚氯仿手工提法、溶液型试剂盒方法等其他方法提取DNA，硅胶膜离心柱吸附法步骤如下：（1）向装有20µl蛋白酶的离心管中加入200µl全血；（2）加入200µl裂解缓冲液，脉冲式涡旋15秒混匀；（3）56℃孵育10分钟，短暂离心以移除附于管盖内的液体；（4）加入200µl乙醇（96-100%）于微量离心管中，脉冲式涡旋15秒混匀，短暂离心以移除附于管盖内的液体；（5）将上述混合液加入离心柱中（置于收集管中），6000×g离心1分钟，换入新的收集管中；（6）加入500µl漂洗缓冲液1，6000×g离心1分钟，换入新的收集管中；（7）加入500µl漂洗缓冲液2，20000×g离心3分钟；（8）离心柱放入一个新的微量离心管中，加入200µl洗脱缓冲液或蒸馏水，室温（15-25℃）孵育1分钟，6000×g离心1分钟，收集DNA提取液；（9）将收集到的DNA提取液经核酸测定仪测得DNA浓度及纯度，-20℃存放备用。抽取受试者外周静脉血。也可以用酚-氯仿抽提、溶液型试剂盒等方法提取DNA。酚-氯仿抽提法提取DNA所需主要试剂包括苯酚、异丙醇、乙醇、蛋白酶K、磷酸盐缓冲液等；溶液型试剂盒法提取DNA所需主要试剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-Cl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰核糖核酸（RNA）酶、异丙醇、乙醇等。2、重亚硫酸盐修饰采用重亚硫酸盐对基因组DNA进行甲基化修饰，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，用作扩增模板，即：用重亚硫酸盐处理和转化提取的基因组DNA样品（采用甲基化DNA转化试剂盒EZDNAMethylation-GoldKit货号：D5005），步骤如下：（1）配制转化剂：将900µl水、300µl稀释缓冲液和50µl溶解缓冲液加入到转化剂管中，涡旋振动混匀；（2）将130µl转化剂加入到20ulDNA样本中；（3）将样本放在PCR仪中，98℃孵育10分钟，64℃孵育2.5小时，可4℃贮存；（4）将600µl结合缓冲液加入离心柱中，置于收集管中；（5）将来自第2步的样本加入装有结合缓冲液的离心柱中，盖紧管盖反复颠倒混匀；（6）最高速（≥10000×g）离心30秒，弃掉滤液；（7）将100µl洗涤缓冲液加入上述离心柱中，最高速离心30秒；（8）将200µl脱磺化缓冲液加入离心柱中室温孵育15-20分钟，最高速离心30秒；（9）将200µl洗涤缓冲液加入离心柱中，最高速离心30秒。再加入200µl洗涤缓冲液，最高速离心30秒；（10）将离心柱加入微量离心管中，向离心柱中加入10µl洗脱缓冲液，最高速离心30秒以洗脱DNA；（11）分光光度计法测DNA浓度和纯度，保存于-20℃。3、实时定量甲基化特异性PCR反应实时定量甲基化特异性PCR方法对目的基因SOCS1启动子和内参基因ALU-C4进行扩增。分别用目的基因SOCS1启动子的甲基化特异性引物对和探针、内参基因ALU-C4的特异性引物对和Taqman荧光探针序列，对处理过的DNA进行实时定量聚合酶链式（PCR）反应,其中阴性对照是将体系中DNA模板替换为高压的双蒸馏水，阳性对照是将体系中DNA模板替换为100%甲基化的人基因组DNA，即从健康人白细胞中提取的DNA，通过CpG甲基化转移酶进行体外甲基化后，通过重亚硫酸盐修饰获得。反应体系如下表1：表1实时定量甲基化特异性PCR反应体系试剂加入量高压的双蒸馏水5.5μl上游引物（10μmol/L）0.5μl下游引物（10μmol/L）0.5μl探针（10μmol/L）0.25μl5×预混PCR反应体系2μlDNA模板（10-20ng）1.25μl其中，上游引物和下游引物指的是：目的基因SOCS1和内参基因ALU-C4的特异性引物对，即：前面所述的SOCS1-上游引物、SOCS1-下游引物；ALU-C4-上游引物、ALU-C4-下游引物；探针指的是目的基因SOCS1和内参基因ALU-C4的荧光探针，即：前面所述的SOCS1-探针和ALU-C4-探针。5×预混PCR反应体系为市场出售产品，其中含有热启动Taq聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷、氯化镁、反应缓冲液、PCR反应的增强剂、优化剂以及稳定剂。反应条件如下：加热至95℃，保温1-10分钟，共1个循环；加热至95℃，保温5-40秒，在58-64℃的温度下，退火20-40秒，72℃延伸20-60秒，35-60个循环；72℃延伸4-10分钟1个循环。4、数据计算对待测样本进行实时定量结果分析，检测待测样本DNA甲基化程度，通过荧光PCR仪配套软件获得各PCR反应管的甲基化反应的阈值循环值（Cp值为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数），按照以下计算公式计算得到SOCS1甲基化程度。甲基化率=100%×2exp-[ΔCp(样品SOCS1Cp值-样品ALU-C4Cp值)-ΔCp（阳性对照SOCS1Cp值-阳性对照ALU-C4Cp值）]甲基化率<4定义为阴性结果（非甲基化），甲基化率≥4定义为阳性结果（甲基化）。5、结果分析实时定量甲基化特异性PCR实验结果显示，比较80例慢加急性肝衰竭患者，60例慢性乙型肝炎患者及30例正常对照者SOCS1甲基化水平发现，如图1所示，慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率明显高于慢性乙型肝炎患者和正常对照（P<0.01），而激素治疗组与保守治疗组之间没有明显差异。慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与临床指标的相关性。分析80例慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与临床指标的相关性，统计结果显示肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与血清TBIL、HBVDNA、PTA、PT-INR和MELD积分的相关性，如图2所示，A图为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与血清TBIL成正相关关系，B图为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与HBVDNA评分成负相关关系，C图为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与PTA成负相关关系，D图为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与PT-INR成正相关关系，E图为慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子甲基化率与MELD评分成正相关关系。肝衰竭患者SOCS1甲基化程度与患者预后及糖皮质激素治疗疗效有关。慢加急性肝衰竭患者80例，接受糖皮质激素治疗后1个月，其中存活54例（占比67.5%），死亡26例（占比32.5%），在激素治疗组与保守治疗组两组内，死亡组患者甲基化率均明显高于存活组（激素治疗组：存活组[median16.84,interquartilerange2.52–54.71]，死亡组[median66.71,interquartilerange43.71–83.21]，P<0.01；保守治疗组：存活组[median4.64,interquartilerange1.17–13.68]，死亡组[median65.36,interquartilerange52.50–73.33]，P<0.01），如图3A所示。接受糖皮质激素治疗后3个月，其中存活33例（占比41.25%），死亡47例（占比58.75%），在激素治疗组与保守治疗组两组内，死亡组患者甲基化率均明显高于存活组（激素治疗组：存活组[median9.74,interquartilerange1.92–21.76]，死亡组[median59.90,interquartilerange24.74–74.06]，P<0.01；保守治疗组：存活组[median1.96,interquartilerange0.11–12.79]，死亡组[median61.56,interquartilerange4.67–73.71]，P<0.01），如图3B所示。本发明检测了80例慢加急性肝衰竭患者外周血SOCS1基因启动子的甲基化程度，发现与SOCS1启动子区呈低甲基化的慢加急性肝衰竭患者相比，SOCS1启动子区呈高甲基化的患者的1个月(P=0.014)和3个月(P=0.003)的预后差，见图4A和4B。上述结果提示SOCS1基因启动子高甲基化的重症肝炎患者病情严重，预后不佳。慢加急性肝衰竭患者1个月死亡率为32.5%(26/80)。死亡组(median65.36,interquartilerange50.29–76.18)患者甲基化率明显高于存活组(median12.76,interquartilerange2.20–39.20;P<0.01)。利用SOCS1基因启动子甲基化率来判断慢加急性肝衰竭患者1个月预后的受试者工作特征曲线，见图4C。选取截断点为甲基化率46.98%，SOCS1甲基化率判断慢加急性肝衰竭预后的ROC曲线下面积为0.797（95%可信区间：0.693–0.879），选取截断点为甲基化率46.98%，敏感性为80.77%，特异性为77.78%，阳性预测值为63.6%，阴性预测值为89.4%。慢加急性肝衰竭患者3个月死亡率为58.75%(47/80)。死亡组(median61.56,interquartilerange21.76–73.71)患者甲基化率明显高于存活组(median8.72,interquartilerange1.45–17.51;P<0.01)。利用SOCS1基因启动子甲基化率来判断慢加急性肝衰竭患者3个月预后的受试者工作特征曲线，如图4D所示。选取截断点为甲基化率36.60%，SOCS1甲基化率判断慢加急性肝衰竭预后的ROC曲线下面积为0.825（95%可信区间：0.724–0.901)，选取截断点为甲基化率36.60%，敏感性为68.09%，特异性为93.94%，阳性预测值为94.1%，阴性预测值为67.4%。慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因启动子区甲基化水平对于预后判断的特异性和敏感性，说明它可作为判断慢加急性肝衰竭患者预后的分子标志。本发明检测了糖皮质激素对慢加急性肝衰竭患者预后的影响，图5为激素治疗组患者1个月（P=0.034）和3个月（P=0.034）的生存率明显高于保守治疗组，说明糖皮质激素的应用能改善慢加急性肝衰竭患者的预后。在SOCS1启动子区呈高甲基化的慢加急性肝衰竭患者中，激素治疗组患者的1个月生存率明显高于保守治疗组(P=0.020)。而在SOCS1启动子区呈低甲基化的慢加急性肝衰竭患者中，激素治疗组与保守治疗组患者的生存率没有明显差异(P=0.190)，如图6所示，上述结果说明，高甲基化的慢加急性肝衰竭患者对糖皮质激素治疗效果反应较好，通过检测慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因甲基化水平,可以成为使用糖皮质激素治疗慢加急性肝衰竭的筛选条件。本发明经过广泛而深入的研究，对多例慢加急性肝衰竭患者外周血基因组DNASOCS1启动子的甲基化程度进行了分析，利用本发明所述的试剂盒检测发现，在预后差的慢加急性肝衰竭患者中SOCS1启动子区呈高甲基化，而在预后好的慢加急性肝衰竭患者中SOCS1启动子区呈低甲基化，提示SOCS1基因启动子高甲基化的重症肝炎患者病情严重，预后不佳，该基因启动子区甲基化程度对于判断慢加急性肝衰竭患者预后具有特异性和敏感性，说明SOCS1启动子甲基化程度可作为判断慢加急性肝衰竭患者预后的分子标志，SOCS1基因启动子在慢加急性肝衰竭死亡组患者中甲基化程度高，还表明SOCS1基因启动子甲基化程度可以用来预测慢加急性肝衰竭患者的预后，可作为医师治疗和用药的参考依据。接受激素治疗患者的生存率明显高于保守治疗组，说明糖皮质激素的应用能改善慢加急性肝衰竭患者的预后，在SOCS1启动子区呈高甲基化的慢加急性肝衰竭患者中，激素治疗组患者的生存率明显高于保守治疗组；而在SOCS1启动子区呈低甲基化的慢加急性肝衰竭患者中，激素治疗组与保守治疗组患者的生存率没有明显差异，上述结果说明，高甲基化的慢加急性肝衰竭患者对糖皮质激素治疗效果反应较好，通过检测慢加急性肝衰竭患者SOCS1基因甲基化水平,可以成为使用糖皮质激素治疗慢加急性肝衰竭的筛选条件，本发明的试剂盒包含定量检测SOCS1基因启动子甲基化程度的试剂，具有快速、准确的特点，对判断慢加急性肝衰竭患者预后具有显著的优越性，适于大规模推广应用。上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书的一种糖皮质激素治疗肝衰竭效果的定量检测方法及试剂盒且任何所属
技术领域：
的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。当前第1页1 2 3