一种检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的方法及试剂盒与流程

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的方法及试剂盒。

背景技术：

乙醛脱氢酶2(Aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是酒精代谢的关键酶，它能催化乙醇代谢产生的有毒、致癌的乙醛脱氢转变为无毒的乙酸。此外，ALDH2还兼具硝酸酯酶活性，是硝酸甘油的有效代谢物一氧化氮形成的关键。

ALDH2基因包含13个外显子，外显子12中存在一个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点，其dbSNP编号为rs671，是开放读码框第1510位碱基发生G→A的突变(G1510A)，导致多肽链第487位的谷氨酸变为赖氨酸(Glu487Lys)，个体若携带ALDH2基因Glu487Lys突变，饮酒后将使酒精在体内的代谢过程受阻，导致大量乙醛滞留在体内，损伤肝脏，导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌。如果心绞痛患者携带ALDH2(Glu487lys)突变，ALDH2的硝酸酯酶活性会降低10倍以上，使其救命药硝酸甘油无法产生足够的一氧化氮，从而难以发挥药效。在亚洲人群中，30％-50％的个体都携带ALDH2突变基因，故检测个体ALDH2基因rs671位点的基因型，对于预测其酒精代谢能力和对硝酸甘油的敏感性具有重要临床意义。

目前，检测ALDH2基因rs671位点基因型的方法有PCR-PFLP、Sanger双脱氧链终止法测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、荧光定量PCR、焦磷酸测序、微测序、基因芯片、高分辨率熔解曲线法(HRM)等，除PCR-RFLP法外，其他方法均需昂贵设备，操作相对繁琐，检测周期长，检测成本高，部分方法还存在结果不稳定、重复性差等缺点。相反，PCR-RFLP法操作简单，对仪器设备要求低，但该法若采用常规的引物设计，会因为内切酶的活性降低、酶切时间、酶切体系的不恰当等原因造成酶切不完全导致基因型误判。

以文献报道的引物对为例：

F1：5'-CAAATTACAGGGTCAACTGCTATG-3'(SEQ ID NO.1)；

R1：5'-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3'(SEQ ID NO.2)。

文献来源：Lee CH,Lee JM,Wu DC,et al.Carcinogenetic impact of ADH1B and ALDH2 genes on squamous cell carcinoma risk of the esophagus with regard to the consumption of alcohol,tobacco and betel quid[J].Int J Cancer,2008,122(6):1347-1356.

上述引物对靶向扩增的PCR产物为135bp，使用限制性核酸内切酶MboⅡ【切割序列为GAAGA(8/7)^】酶切PCR产物进行基因分型(如图1)，3种基因型判断依据为：

野生型纯合子GG：125bp、10bp；

杂合子GA：135bp、125bp、10bp；

突变型纯合子AA：135bp。

假如在实验中发生酶切不完全即残留PCR产物(长度为135bp)的情况，GG基因型的样品将呈现135bp、125bp、10bp的条带，有可能会被当作GA型对待，如表1所示。

表1不带内对照酶切位点的实验设计可能出现的基因型误判

上述方法除了缺乏内对照酶切位点容易引起基因型误判之外，电泳图谱的制作也较为繁琐，因为135bp、125bp两个片段大小仅相差10bp，通常需要聚丙烯酰胺凝胶电泳或高浓度的琼脂糖凝胶电泳才能将其分开，故限制了它的应用。

此外，该位点的酶切分型还可采用EcoRⅠ、AcuⅠ、TspRⅠ等限制性核酸内切酶，不过均存在一定的不足。

在现有的EcoRⅠ方案中，引物3′端须有2个碱基错配，方能形成用EcoRⅠ来甄别野生型等位基因和突变型等位基因的识别序列，故PCR效率极低，且酶切产物无法用琼脂糖凝胶电泳分型，需用聚丙烯酰胺凝胶电泳，增加了检测时间，并且该方案也缺乏内对照酶切位点，存在基因型误判的可能。

至于AcuⅠ，该酶价格相对较贵，Thermo Fisher Scientific Inc.的官网报价为20次反应267元人民币，每次反应13.35元；相反，MboⅡ为50次反应380元，每次反应7.6元。另外，现有的使用AcuⅠ酶切的方案也缺乏内对照酶切位点，存在基因型误判的可能。

至于TspRⅠ(TscAⅠ)，其价格与MboⅡ一致，但酶切后的酶灭活操作较为繁琐，说明书建议使用酚/氯仿抽提、酒精沉淀，而不像MboⅡ65℃灭活5min即可。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种简便、快捷、准确性高的检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的方法，包括如下步骤：

(1)提取待检样品基因组DNA；

(2)设计PCR引物对，所述PCR引物对扩增产物中引入一个内对照酶切位点和一个包含多态位点的识别序列，所述的识别序列只有在多态位点为其中一种碱基的情况下被所述限制性内切酶识别；

(3)利用步骤(2)所设计的PCR引物对对待检样品基因组DNA进行PCR扩增；

(4)利用特定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切；

(5)根据酶切产物的电泳图谱确定ALDH2基因rs671位点的基因型。

所述的内对照酶切位点与多态位点之间的距离以其酶切产物能够被区分为准。

作为优选的，所述的内对照酶切位点的碱基序列符合GAAGA模式，并能被所述的限制性内切酶识别。

作为优选的，所述的识别序列符合RAAGA模式，其中R为多态位点，R＝G/A。

作为优选的，所述的限制性内切酶为MboⅡ或其同裂酶NcuⅠ、TceⅠ。

作为优选的，所述的PCR引物对为：

F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTAACCCATAACCCCGAAGAGT-3′(SEQ ID NO.3)，

R：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGCACACTCACAGTTTTCTCTT-3′(SEQ ID NO.4)。

一种用于检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的引物对，其扩增产物中引入一个内对照酶切位点和一个包含多态位点的识别序列，所述的识别序列只有在多态位点为其中一种碱基的情况下被所述限制性内切酶识别。

作为优选的，所述的内对照酶切位点的碱基序列符合GAAGA模式，并能被所述的限制性内切酶识别；所述的识别序列符合RAAGA模式，其中R为多态位点，R＝G/A；所述的限制性内切酶为MboⅡ或其同裂酶NcuⅠ、TceⅠ(如图2所示)。

一种用于检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的试剂盒，其包括以上任一项所述的用于检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的引物对及限制性内切酶。

本发明的有益效果是：

本发明在检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的过程中引入了特有的“内部质控”机制，即在PCR产物中引入内对照酶切位点，可根据酶切图谱识别酶切不完全的情形，并且在酶切不完全的情况下以及部分酶切条带模糊不清的情况下依旧可以准确判断基因型，极大地提高了检测结果的准确性(示意图见图3)，并且检测成本相对较低，操作简便，适于试剂盒规模化生产。

附图说明

图1：现有文献引物扩增的PCR产物结合MboⅡ酶切对ALDH2基因rs671多态位点分型示意图，图中R＝G/A，代表多态位点碱基，其在互补链中为Y＝C/T，加框的为MboⅡ识别序列，箭头为MboⅡ的切割位点，绿色背景的碱基为引物序列；

图2：跨越ALDH2基因rs671多态位点的PCR产物中含MboⅡ及其同裂酶NcuⅠ、TceⅠ内对照酶识别位点；

图3：跨越ALDH2基因rs671多态位点的PCR产物经MboⅡ或其同裂酶NcuⅠ、TceⅠ酶切后的电泳图谱示意图；

图4：使用本发明引物对扩增的PCR产物序列及MboⅡ酶切位点分布图，图中箭头为MboⅡ的切割位点；

图5：PCR产物琼脂糖凝胶电泳图【M:DL2000DNA分子量标记；1、2、3、4、5:224bp PCR产物】；

图6：ALDH2基因rs671多态位点的基因分型电泳图谱【图中显示所有样品酶切完全；M：DNA分子量标记Marker1，东盛生物科技有限公司；P：PCR产物(224bp)；1、2、3：野生型纯合子GG；4、6：突变型纯合子AA；5、7、8、9：杂合子GA】；

图7：ALDH2基因rs671多态位点的基因分型电泳图谱【图中显示2号样品酶切不完全，有PCR产物残留；M：DNA分子量标记Marker1，东盛生物科技有限公司；P：PCR产物(224bp)；1、2：杂合子GA；3：突变型纯合子AA】；

图8：ALDH2基因rs671多态位点3种基因型样品的PCR产物测序峰图，从左至右依次为GG、GA、AA基因型，加框的碱基为多态位点碱基。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

本实施例针对限制性内切酶MboⅡ设计了一对用于检测ALDH2基因rs671位点基因型的引物对，并建立了ALDH2基因rs671多态位点基因型的检测方法，具体如下：

1.基因组DNA提取

采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，按说明书的操作步骤提取基因组DNA。DNA来源不限于此，任何体细胞来源的DNA均可。

2.引物设计

dbSNP数据库中查找ALDH2基因rs671多态位点相关的DNA序列(参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp？term＝rs671)，调取ALDH2基因rs671多态位点前后各1000bp的序列(参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_012250.1)，42421位碱基为多态位点碱基，此序列显示野生型等位基因的碱基g。ALDH2基因在GenBank上的登录号为NG_012250.1，利用Primer Premier 5.0软件设计针对该位点的特异性分型引物。其中，上游引物位于多态位点的5′端1000bp以内，下游引物位于多态位点的3′端1000bp以内。上游引物在3′端倒数第7位改变一个碱基(C→G)，通过PCR扩增引进一个内对照酶识别位点(GAAGA，其中G由错配引物引入)，下游引物3′端倒数第4位改变一个碱基(A→T)，通过PCR扩增在野生等位基因G的多态位点附近形成GAAGA(A由错配引物引入)序列，成为MboⅡ识别序列，突变型等位基因的相应序列为AAAGA(A由错配引物引入)，不能为MboⅡ识别，故可用MboⅡ甄别多态位点。上游引物5′端加下划直线的序列5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO.5)是与模板无关的附加序列，源于通用测序引物T7，该附加序列的主要目的，在于增加原始PCR产物和仅在内对照酶切位点被切开的PCR产物(即突变型等位基因的PCR产物)之间的电泳区分度；下游引物5′端加下划波浪线的序列5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′(SEQ ID NO.6)也是与模板无关的附加序列，它不影响PCR的特异性，但可增加PCR产物酶切后野生型等位基因和突变型等位基因片段之间的区分度。

根据上述引物设计方案，获得引物对如下：

F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTAACCCATAACCCCGAAGAGT-3′(SEQ ID NO.3)，

R：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGCACACTCACAGTTTTCTCTT-3′(SEQ ID NO.4)，

PCR产物大小为224bp。

使用上述引物对扩增的PCR产物序列及MboⅡ酶切位点分布如图4所示。

完全酶切时：

ALDH2基因rs671多态位点的基因型为GG时，酶切产物的大小分别为139bp、46.5bp、38.5bp；

ALDH2基因rs671多态位点的基因型为GA时，酶切产物的大小分别为177.5bp、139bp、46.5bp、38.5bp；

ALDH2基因rs671多态位点的基因型为AA时，酶切产物的大小分别为177.5bp、46.5bp。

实际上仅根据177.5bp、139bp两个片段的组合情况就可区分3种基因型。

酶切不完全时，将会残留和PCR产物一样大小的224bp的片段，但它不会影响基因型的判断，即实验人员可根据177.5bp、139bp、46.5bp、38.5bp片段的组合情况来分辨基因型，实际上仅凭177.5bp、139bp二种特征条带的有无就可甄别3种基因型。

3.目的片段的PCR扩增及鉴定

PCR反应体系：

PCR反应条件：

PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

4.PCR产物的酶切分型

本实施例所采用的限制性核酸内切酶为Thermo Scientific的快速限制性核酸内切酶MboⅡ。

酶切体系总体积为30μL，具体配方如下：

其中PCR产物的量可以视PCR产物的浓度加以调整，通常为10～26μL，相应的ddH₂O随之加以改变。

酶切在37℃水浴锅中进行，时间为15min。然后于65℃水浴保温5min以灭活内切酶。酶切产物行3％琼脂糖凝胶电泳，通过观察电泳条带的大小和数目以确定基因型。

5.测序验证本方法的准确性

选取上述PCR-RFLP法检出的3种基因型样品各1例，PCR扩增相应的靶片段进行Sanger法测序，结果表明，本发明所设计的分型引物，可以对ALDH2基因rs671多态位点的基因型进行准确的检测。

6.实际检测案例

提取受检者基因组DNA，利用引物对进行PCR扩增，利用限制性核酸内切酶MboⅡ对PCR产物进行酶切。

图5为PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，条带非常单一，说明引物的特异性非常高；

图6为PCR产物完全酶切电泳图谱，可非常清晰直观地判断基因型；

图7中有一个样品的酶切不完全，残留了非常明显的PCR产物带，本发明不仅可以察觉到此点，并且根据特征带依然可以分辨出基因型；

图8为本方案检出的3种基因型样品，测序结果完全吻合。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东药科大学

<120> 一种检测ALDH2基因rs671多态位点基因型的方法及试剂盒

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