用于从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的试剂盒的制作方法

技术特征：

1.用于从幼稚T细胞诱导扩增调节性T细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：anti‐CD3抗体、PBS缓冲液、淋巴细胞分离液、 CD4⁺T Cell Biotin‐Antibody Cocktail II抗体、Naive CD4⁺T Cell Micro Bead Cocktail II磁珠、Treg诱导培养基。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Treg诱导培养基的配方比例为：已添加2.06mM Glutamax‐I和25mM HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基，向所述RPMI 1640培养基中加入10％v/v自体血清，并加入终浓度为200U/ml重组人IL‐2、1‐5ng/ml重组人TGF‐β1、0.1‐10μg/ml anti‐CD28、10‐200nM雷帕霉素。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)anti‐CD3抗体包被：细胞培养，在24孔培养板中每孔加入含0.1‐2μg/ml anti‐CD3抗体的PBS缓冲液1mL置于4℃孵育1h至24h备用，其他孔板根据体积或底面积换算；

(2)外周血单个核细胞的分离：抽取肝素抗凝静脉血20ml，取3支15ml管离心管，每管加入淋巴细胞分离液4ml，将6‐7mL外周血沿管壁缓慢置于淋巴细胞分离液层面之上，800g离心17min，分别收集血浆和外周血单个核细胞，血浆56℃水浴灭活补体，外周血单个核细胞加入足量的生理盐水洗涤1‐2次；

(3)磁珠分选幼稚T细胞：将所述步骤(2)中获得的外周血单个核细胞进行计数，加PBS洗涤，用美天旎磁珠阴性分选幼稚T细胞；每10⁷细胞以40μl缓冲液重悬，加入10μl CD4⁺T Cell Biotin‐Antibody Cocktail II抗体，混匀后4℃孵育5min；加入30μl缓冲液、20μl的Naive CD4⁺T Cell Micro Bead Cocktail II磁珠，混匀后4℃孵育10min，得到细胞混合液；用3‐5ml缓冲液平衡LD型细胞分选柱，将所得的细胞混合液加入平衡后的LD型细胞分选柱，用3‐5ml缓冲液洗涤装有细胞混合物的离心管后加入所述细胞分选柱，收集过柱后的细胞悬液，得到阴选的未被抗体结合的细胞，即幼稚T细胞；

(4)诱导扩增培养：将包被anti‐CD3的培养板从4℃取出于置于37℃培养箱平衡；吸去PBS；将幼稚T细胞重悬于Treg诱导培养基，调整至0.2‐2×10⁶/孔接种于包被anti‐CD3的培养板。