牙龈间充质干细胞的原代分离方法与流程

本发明涉及细胞领域，特别涉及牙龈间充质干细胞的原代分离方法。
背景技术：
：间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明，间充质干细胞来源十分广泛，除骨髓外，脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部，特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。在牙科学领域的研究中，牙髓、牙周膜、颌骨、根尖牙乳头等成体颌面组织中的牙源性间充质干细胞具有强大的组织再生能力，在一系列研究中展现了缺损修复再生的良好应用前景。如牙周膜干细胞等表现出对免疫细胞活性的调节作用。牙龈作为牙周组织的屏障，对机体状态、口腔环境变化很敏感，容易产生增生等诸多疾病表型，而且牙龈本身具有强大的愈合能力，这些现象暗示牙龈组织中可能存在对组织动态平衡和损伤修复具有重要作用的未分化间充质干细胞。牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有层两部分，从发育来源上，上皮来自原始口腔上皮，与口腔粘膜上皮相延续；固有层则发育自早期神经嵴细胞迁移形成的间充质，上皮与间充质不断相互作用，最终形成牙龈组织。。牙龈组织的一个典型特点是具有较强的创伤愈合能力，表现为切除、损伤后能够无疤愈合，恢复牙龈外形。牙龈间充质干细胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞,来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。因此GMSCs在许多生理和病理过程中都起着十分重要的作用，可以维持胶原动态平衡，调节细胞相互作用，保护和修复牙龈组织，维持牙龈组织自身稳定性。目前关于牙龈间充质干细胞原代分离技术的研究报道尚少，《牙龈间充质干细胞与牙周膜干细胞膜片牙周再生能力的实验研究》和《正常和增生牙龈来源间充质干细胞的鉴定及其功能研究》两篇报道，牙龈组织均单独采用Ⅰ型胶原酶进行酶解60min，Ⅰ型胶原酶较高的酶解活性和上时间的作用对细胞会造成比较大的损害；另外，牙龈组织一般收集量较少，只进行一次酶解，细胞收获率不高。在细胞纯化技术方面，报道文献多采用单克隆法进行细胞纯化，虽然此方法纯化率高，但实验周期太长。此外，GMSCs常规培养通常采用含10％FBS的DMEM或者DMEM/F12培养基，添加的FBS属于动物来源血清，成分复杂，并存在引入污染和过敏原的风险，不适合于临床应用。特别是在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种牙龈间充质干细胞的原代分离方法。本发明采用二次消化法，在第一次酶解的基础上，对仍未消化的组织块，采用胰蛋白酶进行第二次酶解，提高了细胞的收获率，减少细胞丢失。本发明使用的GMSCs完全培养基不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种牙龈间充质干细胞的原代分离方法，包括如下步骤：步骤1：获得牙龈组织，漂洗；步骤2：取步骤1获得的漂洗后的牙龈组织，剪碎后与消化酶组合物混合后消化，洗涤，收集细胞；步骤3：取步骤2中过滤后的未消化的牙龈组织与胰蛋白酶混合后消化，离心，洗涤，收集细胞；步骤4：取步骤2获得的细胞与步骤3获得细胞混合，用培养基重悬后培养，纯化；步骤2中所述消化酶组合物为Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤2中所述消化酶组合物与牙龈组织的体积比为1:1～5:1。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤2中所述消化酶组合物中Ⅰ型胶原酶与Dispase酶的体积比为1:1～1:5；所述消化酶组合物中Ⅰ型胶原酶的浓度为3g/L，Dispase酶的浓度为4g/L。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤2中Ⅰ型胶原酶的酶活为≥250U/mg，Dispase酶的酶活为≥0.8U/mg。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤3中所述胰蛋白酶与牙龈组织的体积比为1:1～1:5。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤3中所述胰蛋白酶的质量浓度为0.125％，胰蛋白酶的酶活为≥250U/mg。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤4中培养基为添加表皮生长因子的间充质干细胞无血清培养基。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法所述培养基中所述表皮生长因子的浓度为1～20ng/mL。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤2中所述消化为于37℃，200R消化45min。步骤3中所述消化为于37℃，200R消化15min。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤2或步骤3中所述洗涤为离心，重悬细胞，过滤，收集悬液，离心后收集细胞；所述离心为1000r/min离心5min。其中，步骤2中过滤的细胞滤网的孔径为100μm；步骤3中过滤的细胞滤网的孔径为70μm。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤1中漂洗为取牙龈组织，用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。在本发明的一些具体实施方案中，所述原代分离方法步骤4中纯化为待细胞长满80～90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞；将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs。本发明采用较为温和的Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，减少消化时间，降低酶对细胞的损伤。同时本发明采用二次消化法，在第一次酶解的基础上，对仍未消化的组织块，采用胰蛋白酶进行第二次酶解，提高了细胞的收获率，减少细胞丢失。此外，本发明采用磁珠分选法对P1代细胞进行筛选，能快速精确的筛选出GMSCs，缩短实验周期。另一方面，本发明采用无血清培养基则避免了在细胞治疗中，异源性蛋白的存在，可能会引起不必要的，甚至是未知的不良反应，严重影响治疗结果的风险。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示GMSCs细胞表面标志物流式检测结果图；图2示牙龈组织不同原代分离方法细胞获得率比较；图3示对比例2GMSCs生长曲线图；图4示实施例8GMSCs生长曲线图；图5示对比例3GMSCs成骨分化实验细胞效果图；图6示实施例11GMSCs成骨分化实验细胞效果图；图7示对比例3GMSCs成脂分化实验细胞效果图；图8示实施例11GMSCs成脂分化实验细胞效果图具体实施方式本发明公开了一种牙龈间充质干细胞的原代分离方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；其中，3倍双抗浓度为300u/ml青霉素、300u/mL链霉素。其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。3)第一次消化：将牙龈组织剪成1mm3大小，加入Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1-1:5，优选1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液与组织块体积比为1:1-5:1，优选2:1。其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；其中，所用细胞滤网孔径为100um；其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1-1:5，优选1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；其中，所用细胞滤网孔径为70um；其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含10ng/mlEGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为1～20ng/ml，优选10ng/ml；6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。本发明采用二次消化法，在第一次酶解的基础上，对仍未消化的组织块，采用胰蛋白酶进行第二次酶解，提高了细胞的收获率，减少细胞丢失。本发明采用磁珠分选法对P1代细胞进行筛选，能快速精确的筛选出GMSCs，缩短实验周期。本发明使用的GMSCs完全培养基不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规细胞冻存液相比具有更高的临床安全性。本发明提供的牙龈间充质干细胞的原代分离方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1GMSCs原代分离培养1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。3)第一次消化：将牙龈组织剪成1mm3大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1-1:5，优选1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液与组织块体积比为1:1-5:1，优选2:1。其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；其中，所用细胞滤网孔径为100um；其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。其中，胰蛋白酶与牙龈组织的比例为体积比1:1-1:5，优选1:1，胰蛋白酶的浓度为0.125％；其中，所用细胞滤网孔径为70um；其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。5)接种：步骤3)与步骤4)中收集的细胞用含EGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，接种于六孔板，5％CO2培养箱37℃培养。其中，基础培养基为间充质干细胞无血清培养基，可市场购买或自制。其中，完全培养基中EGF(表皮生长因子)的浓度为1～20ng/mL，优选10ng/mL；6)纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育1h，与磁珠30min4℃孵育，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+GMSCs，接种于新的六孔板中，5％CO2培养箱37℃培养。实施例2GMSCs表面标志物鉴定：待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×106个)，加入3g/LTriton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD146、CD105、CD90、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50uL，同时对照组滴加单纯PBS50ul，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，10％福尔马林固定细胞，流式细胞仪测定抗原的阳性率。检测结果显示，克隆细胞表面抗原CD146、CD105、CD90阳性表达，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，说明本发明中得到的GMSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。表1GMSCs细胞表面标志物表达率结果细胞表型CD146CD105CD90HLA-DRCD34CD45阳性表达率(％)100.0099.9096.700.300.000.10实施例3GMSCs传代：待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入2～3mL0.25％胰蛋白酶，消化1～3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5～10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入5-10mL含10ng/mLEGF的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，进行细胞计数，按5×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。对比例1按《正常和增生牙龈来源间充质干细胞的鉴定及其功能研究》中的方法，原代分离GMSCs，细胞接种到10cm培养皿中，5％CO2培养箱37℃培养，4h后完全更换培养液，弃去未贴壁的细胞。12h后加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，进行细胞计数。实施例5按本发明实施例1的方法，原代分离GMSCs，细胞接种到10cm培养皿中，5％CO2培养箱37℃培养，4h后完全更换培养液，弃去未贴壁的细胞。12h后加入2-3mL0.25％胰蛋白酶，消化1～3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入5-10mL间充质干细胞无血清培养基终止消化，收集细胞，进行细胞计数。实施例6将对比例1与实施例5细胞计数得到的数据进行比较，结果表明(表2，图2)，采用本发明的原代分离技术细胞的收获率显著(P＜0.01)高于对比例1。表2牙龈组织不同原代分离方法细胞获得率计数结果注：**表示p<0.01。对比例2取P3代GMSCs，采用《正常和增生牙龈来源间充质干细胞的鉴定及其功能研究》中培养基配方，含10％FBS的DMEM培养液进行培养。细胞按1×104个/mL密度接种于24孔板中，第四天换液一次。每天收集细胞进行细胞计数，每次收集计算三孔，连续7天。绘制细胞生长曲线。实施例8按本发明实施例1的方法，原代分离GMSCs。取P3代GMSCs，采用本发明中的培养基配方，含10ng/mLEGF(表皮生长因子)的间充质干细胞无血清培养基进行培养。细胞按1×104个/mL密度接种于24孔板中，第四天换液一次。每天收集细胞进行细胞计数，每次收集计算三孔，连续7天。绘制细胞生长曲线。实施例9将对比例2与实施例8细胞计数得到的数据制作生长曲线，结果表明(表3，图3、图4)，采用本发明的培养条件GMSCs增殖活性与目前常用的培养条件无显著性差异，说明了本发明中使用的培养基配方适用于GMSCs常规培养。表3对比例2GMSCs每天计数结果表4实施例8GMSCs每天计数结果对比例3取常规技术培养中的P3代GMSCs，分别换成骨成脂诱导液进行成骨成脂分化诱导，21天后对成脂分化组细胞进行油红0染色，28天后对成骨分化组细胞进行茜素红染色。实施例11按本发明实施例1的方法，原代分离GMSCs。取本发明技术培养中的P3代GMSCs，分别换成骨成脂诱导液进行成骨成脂分化诱导，21天后对成脂分化组细胞进行油红0染色，28天后对成骨分化组细胞进行茜素红染色。实施例12对比例3和实施例11GMSCs成骨成脂分化潜能实验结果如图5～图8：成脂成骨分化实验结果表明，成脂分化诱导结果显示两组细胞胞质内均有脂滴形成，成骨分化诱导结果显示两组细胞均明显呈红色的矿化结节，表明采用本发明分离培养技术培养的GMSCs同样保持良好的干细胞特性。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3