一种石油燃料脱硫微生物的筛选和培养方法与流程

本发明属于脱硫技术领域，涉及一种石油燃料脱硫微生物的筛选和培养方法。

背景技术：

目前，相关的脱硫技术大体上可以分为两类：加氢脱硫和非加氢脱硫。加氢脱硫技术主要包括催化裂化进料加氢预处理技术、选择性加氢脱硫技术、非选择性加氢脱硫技术和催化蒸馏加氢脱硫技术；非加氢技术主要包括氧化脱硫技术、吸附脱硫技术、萃取脱硫技术、络合脱硫技术和生物脱硫技术等。

加氢脱硫(HDS)是对液体燃料在一定催化条件下通过加入氢气，经一系列反应后，将难以脱除的有机硫转化为易于脱除的H₂S或其他硫化物而脱除。传统的加氢脱硫技术已有几十年历史，经过改良如研制新型催化剂、优化操作条件等，能够满足柴油的低硫要求。加氢脱硫是现在工业生产中广泛使用且发展比较成熟的脱硫方法，柴油馏分中的硫醇、硫醚、噻吩脱除相对容易，但是脱除柴油中含量较多的二苯并噻吩及其衍生物需要较大的能量。

鉴于加氢脱硫技术存在设备投资较大、操作费用较高、操作条件较苛刻、导致燃料油成本上升等问题，非加氢脱硫技术受到了更多学者的关注。

吸附脱硫是利用吸附剂选择性地吸附含硫化合物，使之与油品分离的一种有效的脱硫方法。与HDS相比，该方法不消耗氢气或氢耗很少，操作条件温和。

氧化脱硫(ODS)技术是在常温、常压和有催化剂存在的条件下，利用氧化剂将燃料油中噻吩类等难以去除的含硫化物氧化成砜或亚砜，然后再选择合适的萃取剂将砜和亚砜从油品中脱除，从而达到脱硫的目的，氧化剂经过再生后可循环使用。

萃取脱硫是根据在溶剂中有机硫化合物和碳氢化合物具有不同溶解度的原理进行脱硫的一种技术。

生物脱硫技术起源于20世纪50年代，具有选择性高、副反应少、反应条件温和、投资少、对燃料热值影响小等优点，成为令人瞩目的清洁柴油生产技术。生物脱硫或微生物脱硫技术利用水相中的生物催化剂，通过氧化或还原反应使油相中硫化物的碳—硫键断开，达到脱硫目的。生物脱硫技术对空间位阻较大的二苯并噻吩类含硫化合物非常有效，可选择性地将燃油中的二苯并噻吩类含硫化合物脱除，达到脱硫的目的。生物脱硫途径有氧化和还原两种。生物氧化脱硫过程又可分为Kodama和4S氧化路径。Kodama路径是在非硫选择性生物催化剂的作用下，剪断苯环上的C-C键，将二苯并噻吩(DBT)代谢成能够溶于水的3-羟基苯并噻吩-2-甲醛，整个含硫化合物转入水相，降低了柴油的热值，工业前景不大。4S氧化路径是在硫选择性生物催化剂的作用下，剪断含硫化合物中的C-S键，将硫氧化成无机硫转入水相，含硫化合物脱去硫原子后仍留在油相中，不损失柴油的热值。

技术实现要素：

针对化学法脱硫技术存在设备投资较大、操作费用较高、操作条件较苛刻、导致燃料油成本上升等问题，本发明提供了一种石油燃料脱硫微生物的筛选和培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种石油燃料脱硫微生物的筛选和培养方法，包括如下步骤：

一、微生物菌株的筛选：

(1)将油田土壤溶于无菌水中，取上清液，将其接种于基础培养基中培养2～4代，再接种于以二苯并噻吩为唯一硫源的选择性培养基中培养4～5代，然后涂布于以二苯并噻吩为唯一硫源的选择性分离平板上培养；

(2)挑选圈较大的菌落，在接种选择性培养基的三角瓶中进行选择培养2～3天后进行初筛，用HPLC测定二苯并噻吩的含量；

(3)根据测定结果，复筛得到一种脱二苯并噻吩脱除率高、遗传稳定性好的脱除二苯并噻吩菌株。

二、微生物菌株的培养：

(1)种子培养

250mL三角瓶中装入基础培养基100mL，将复筛得到的菌株接种到基础培养基中，接种量为1mL/100mL，且菌株浓度达到10⁹个/mL，于25～35℃在有氧条件下震荡，培养48～60h；

(2)选择培养

按照1～5％的接种量将培养好的种子接入选择性培养基中震荡培养，培养温度为25～35℃，培养时间为1～3d。

本发明与现在应用的化学法相比，具有如下优点：

1、可以在常温下操作，能耗比化学法低70～80％；

2、由于不涉及硫回收及尾气处理，故公共工程消耗也较低；

3、工程投资额约为化学法的一半，操作费用低10～25％；

4、具有较强的专一性，可以脱除化学法难以除去的噻吩类化合物，并保留较高的燃烧值(达98％以上)，故其有选择性高、副反应少，工艺清洁无害、反应条件温和，设备简单、投资少(成本和操作费用低)、占地面积小，对燃料热值影响小的优点。

附图说明

图1为DBT标准曲线；

图2为2-HBP标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种石油燃料脱硫微生物的筛选和培养方法，具体实施步骤如下：

一、微生物菌株的筛选：

将高硫油田土壤溶于无菌水中，取上清液，将其接种于基础培养基中培养2～4代，再接种于以二苯并噻吩为唯一硫源的选择性培养基中培养4～5代，然后涂布于以二苯并噻吩为唯一硫源的选择性分离平板上培养。挑选圈较大的菌落，再接种选择性培养基的三角瓶中进行选择培养2～3天后进行初筛，用HPLC(SunFire C18 150×4.6mm，5μm；流动相甲醇:水＝90:10，1.0mL/min，紫外检测波长260nm)测定二苯并噻吩的含量。经过对多个菌群的菌株筛选工作，从分离出来的几十株菌中初筛出十几株脱二苯并噻吩的菌株，最后复筛得到脱二苯并噻吩脱除率高、遗传稳定性好的脱除二苯并噻吩菌株。

二、微生物菌株的种子培养与选择培养

基本培养基：

葡萄糖的质量浓度为10.0g/L，其它成分的质量浓度分别为NH₄Cl 2.0g/L、KH₂PO₄6.3g/L、K₂HPO₄ 8.0g/L、MgCl₂·6H₂O 2.0g/L，微量元素溶液母液和维生素溶液母液的加入量各为1.0mL/L，pH值7.0～7.2。

微量元素母液含有0.5g/L FeCl₂·4H₂O、0.5g/L ZnCl₂、0.5g/L MnCl₂·4H₂O、0.1g/L NaMoO₄·2H₂O、0.05g/L CuCl₂、0.05g/L NaWO₄·2H₂O和120mmol/L HCl。

维生素母液含有400mg/L泛酸钙、200mg/L肌醇、400mg/L烟酸、400mg/L盐酸吡哆醇、200mg/L对氨基甲苯和0.5mg/L维生素B12。

用于基本培养的原料碳源除了葡萄糖之外，还可以是麦芽糖或果糖。

选择性培养基：

可溶性淀粉2.0g/L、二苯并噻吩50mg/L，其它成分的质量浓度分别为：NH₄Cl 2.0g/L、KH₂PO₄ 6.3g/L、K₂HPO 8.0g/L、MgCl₂·6H₂O 2.0g/L，微量元素溶液母液和维生素溶液母液的加入量各为1.0mL/L，pH值7.0～7.2。

用于选择性培养的原料碳源除了可溶性淀粉之外，还可以是葡萄糖、麦芽糖或果糖。

基础培养基和选择性培养基的灭菌温度为115～121℃，灭菌时间为15～20min。

将实验菌株接种到基础培养基中，250mL三角瓶中装培养基100mL，接种量为1mL/100mL，于25～35℃在有氧条件下震荡，培养48～60h。

按照1～5％的接种量将培养好的种子接入选择性培养基中，培养温度为25～35℃，震荡培养1～3d。

将保留的菌株接种到装有20mL上述选择性培养基的三角瓶中，32℃有氧摇甁培养72h。取5mL培养液转接到100mL同样培养基的三角瓶中，控制pH7.3，32℃有氧摇甁培养36h后，过滤，用等体积的正己烷萃取，然后再旋蒸蒸干，再用甲醇溶解，最后用HLPC法测定溶液中二苯并噻吩和2-羟基联苯的含量。

根据图1和图2的标准曲线计算得出表1，最好的结果为：二苯并噻吩被分解的量为80.03％，得到2-羟基联苯的量占二苯并噻吩的量为49.37％，其他30.66％为中间产物，中间产物依然是还有硫的。通过上面阐述可以得出这样的结论：菌株的脱硫率为49.37％。

表1不同培养条件下的二苯并噻吩残留和生成2-羟基联苯的量