一种新型蛋白质表达系统U2‑OS及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及高分泌性表达糖蛋白的u2-os表达系统。

背景技术：

癌细胞是一种变异的细胞，有无限增殖的特点。以前，提起癌细胞人们首先想到的是消灭或者抑制它们。本发明则反其道而行之，利用癌细胞快速增殖、无限传代、容易体外培养及有完整的糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达、生产临床上需要的重要蛋白质分子。本发明方法可以大大提高蛋白质的基因工程表达效率，具有广阔的应用前景。

目前蛋白表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、植物表达系统、昆虫表达系统及哺乳动物表达系统。对于复杂蛋白质分子，由于空间结构及糖基化等问题，必须用哺乳动物细胞表达才可以得到有生物活性的分子。

哺乳动物表达系统主要是cho细胞，cho细胞表达虽然活性提高，但是产量低，培养工艺要求及成本高。本发明利用hbmp-7证实：u2-os可以作为一种新型蛋白质表达系统进行复杂蛋白质分子的生产，其效率及应用于蛋白质生产具有其他细胞无法比拟的优点。这种表达系统可以用于表达生产各种蛋白质因子，如：hbmp家族(hbmp-2----hbmp-28)、生长激素、促性腺激素(hcg,fsh/lh)、胰岛素、各种细胞因子(血红蛋白、干扰素、白细胞介素)或人源抗体。

本发明以hbmp-7为例，说明其技术应用。

人骨形态发生蛋白-7(humanbonemorphogeneticprotein-7，hbmp-7)又名成骨蛋白-1(osteogenicprotein，op-1)，属于转化生长因子-β(transforminggrowthfactor-β，tgf-β)超家族。hbmp-7基因位于人类2号染色体上，包含1293个碱基，编码一个由431个氨基酸组成的前体蛋白。该前体蛋白的n基末端1-29个氨基酸为信号肽，第29-292氨基酸为前肽，第293-431氨基酸为成熟肽。成熟并且具有活性的hbmp-7是由二硫键连接的同源或异源二聚体糖蛋白(bustos-valenzuela,j.c；2010)，相对分子质量为36kd，单体或无糖基化的hbmp-7没有生物活性或生物活性很低。因此该前体蛋白合成分泌后，在人体内必须经过剪切加工成139个氨基酸残基的成熟肽才具有活性。

hbmp-7是一种有重要价值的生长因子(o’heireamhoin,s；2011)：在肾脏形态发生中起关键作用；在骨代谢中，能够诱导成骨，能够促进骨细胞增殖分化并能诱导软骨细胞分化。因hbmp-7具有强烈的骨诱导活性，临床上己将其用于治疗骨折、骨不愈合，促进脊椎愈合等，并取得显著疗效。

hbmp-7的活性形式是一种二聚体糖蛋白，单体或无糖基化的hbmp-7没有生物活性或生物活性很低。因此，该蛋白的表达需经翻译后加工修饰。目前国内表达的hbmp-7产量低、活性低、成本高，不能满足市场需求。因此，研究hbmp-7的生产表达技术具有重要的应用价值和潜在的经济价值。

现阶段原核系统大肠杆菌表达的hbmp-7生物活性很低，而且不稳定。这可能是由于原核表达系统缺乏翻译后修饰功能，使表达的hbmp-7活性远远低于与人体自身表达的hbmp-7。毕赤酵母虽具有翻译后修饰功能，但糖基化形式与人类存在差异且只能表达单体形式的hbmp-7，亦不适合hbmp-7蛋白的表达；昆虫及植物表达系统虽具有负责的蛋白翻译后加工修饰系统，但是考虑到其糖基化差异的问题，目前没有学者采用昆虫及植物表达系统来表达hbmp-7；研究表明哺乳动物cho细胞表达的hbmp-7是二硫键连接的成熟的二聚体，相对分子质量为36kd，具有生物学活性：如可诱导骨的形成及刺激成骨细胞中碱性磷酸酶(alp)的活性。目前，哺乳动物细胞表达hbmp-7的水平仍偏低，一般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限，即1-30μg/l0⁸细胞/24小时。目前cho系统表达的二聚体糖蛋白hbmp-7虽有活性，但表达量仍然很低。因此，如何获得糖基化的二聚体hbmp-7？如何提高hbmp-7的表达量？如何得到纯度较高的hbmp-7？这些都是目前急需解决的问题。

技术实现要素：

为了解决上述问题，在山东省自然科学基金资助项目(项目编号：zr2014cp024)、济南大学自然科学基金青年项目(编号：xky1418)等资助下，本发明提供了一种可广泛表达人源蛋白的表达系统，本发明利用癌细胞u2-os快速增殖及糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达人骨形态发生蛋白hbmp-7。本发明构建氨基末端含不同信号肽的重组表达载体，筛选能高效分泌表达hbmp-7的u2-os细胞；纯化并检测重组hbmp-7的糖基化状态及其生物学活性。该系统能高效分泌表达hbmp-7，且表达的hbmp-7是其高活性形式二聚体糖蛋白。建立了一种新的人源癌细胞hbmp-7蛋白表达系统，克服了二聚体糖蛋白hbmp-7在表达过程中所存在的产量低、活性低等问题。为今后大规模表达和制备细胞因子、人源抗体、疫苗等奠定了基础。

研究发现：与一般的癌细胞不同，人骨肉瘤细胞系u2-os源自15岁女孩胫骨中等分化的骨肉瘤，检测sv40，rsv或腺病毒时未检测到病毒，具有较高的安全性，且细胞系培养条件要求低。

更重要的是，与哺乳动物细胞繁殖慢，哺乳动物糖基化与人细胞存在一定差异性不同；骨肉瘤细胞系u2-os是癌细胞，繁殖快，培养周期短而且培养条件比其他哺乳动物要简单，是人源细胞，糖基化情况与人没有差别。因此，本发明选择骨肉瘤细胞系u2-os作为新的目的蛋白表达系统。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了：人骨肉瘤细胞u2-os在表达蛋白质中的应用。所述表达蛋白质过程中，人骨肉瘤细胞u2-os作为蛋白质表达系统。

优选的，所述蛋白质为hbmp家族(hbmp-2----hbmp-28)、生长激素、促性腺激素(hcg,fsh\lh)、胰岛素、各种细胞因子(血红蛋白、干扰素、白细胞介素)或人源抗体。

本发明中所述“hbmp”为“人骨形态发生蛋白”的缩写。

一般而言，本领域技术人员完全能够构建载体和设计程序，用于在细胞或细胞系中进行相应蛋白质重组基因表达以便于筛选，且上述细胞和细胞系在各种鉴定过程的实施方案中的用途构成本发明的一个方面。合适的载体可选取或构建，包含合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其他合适的序列。

与一般在癌细胞中表达蛋白，研究其癌细胞迁移和侵袭转移的影响不同，本发明在蛋白表达体系选择过程中，充分考虑了表达体系对重组蛋白的表达量、活性、以及安全性和稳定性的影响。研究结果表明：本发明的骨肉瘤细胞系u2-os能高效分泌表达高活性的hbmp-7。本系统表达的hbmp-7重组蛋白产品在纯化后可作为各种bmp-7相关生物医药产品的原料。

本发明还提供了一种在人骨肉瘤细胞u2-os中表达蛋白质的方法，包括：

构建含有基因片段的表达载体，其中所述基因片段含有编码目的蛋白质的dna和选择性标记基因；

将上述的表达载体整合入人骨肉瘤细胞u2-os而获得能够表达目的蛋白质的人骨肉瘤细胞u2-os；

将上述的能够表达目的蛋白质的人骨肉瘤细胞u2-os培养后，提取目的蛋白。

优选的，所述目的蛋白为hbmp家族(hbmp-2----hbmp-28)、生长激素、促性腺激素(hcg,fsh\lh)、胰岛素、各种细胞因子(血红蛋白、干扰素、白细胞介素)或人源抗体。

优选的，所述整合的具体方法为质粒转染。本发明为稳定转染，培养传代到第十代的人骨肉瘤细胞u2-os依然能稳定表达hbmp-7。

优选的，所述目的蛋白为hbmp-7，所述基因片段包括：hbmp-7自身信号肽基因序列、hbmp-7成熟肽基因序列。

更优选的，所述hbmp-7自身信号肽基因序列seqidno:1：

atgcacgtgcgctcactgcgagctgcggcgccgcacagcttcgtggcgctctgggcacccctgttcctgctgcgctccgccctggcc。

更优选的，所述hbmp-7成熟肽基因序列seqidno:3：

tccacggggagcaaacagcgcagccagaaccgctccaagacgcccaagaaccaggaagccctgcggatggccaacgtggcagagaacagcagcagcgaccagaggcaggcctgtaagaagcacgagctgtatgtcagcttccgagacctgggctggcaggactggatcatcgcgcctgaaggctacgccgcctactactgtgagggggagtgtgccttccctctgaactcctacatgaacgccaccaaccacgccatcgtgcagacgctggtccacttcatcaacccggaaacggtgcccaagccctgctgtgcgcccacgcagctcaatgccatctccgtcctctacttcgatgacagctccaacgtcatcctgaagaaatacagaaacatggtggtccgggcctgtggctgccac。

更优选的，所述基因片段还包括his纯化标签的基因序列。

本发明还提供了一种较优的高分泌性二聚体糖蛋白hbmp-7的u2-os表达方法，具体包括如下步骤：

(1)将hbmp-7自身信号肽基因序列、hbmp-7成熟肽基因序列和6×his纯化标签的基因序列连接在一起，三者位于同一读码框内，得到融合基因；其中，目的蛋白(hbmp-7成熟肽)的n末端与hbmp-7自身信号肽相连，目的蛋白的c末端与6×his纯化标签相连；

(2)将步骤(1)所得到的融合基因克隆至真核表达载体pcdna3.1，构建得到融合蛋白的真核表达载体rhb7-hbmp-7-pcdna3.1；

(3)利用lipofectamine2000转染u2-os，筛选稳定转染hbmp-7的u2-os细胞，

(4)将上述的稳定转染hbmp-7的u2-os细胞培养后，提取目的蛋白。

任一上述的方法表达的hbmp-7重组蛋白。

任一上述的方法制备的hbmp-7重组蛋白皆可用于制备人骨成型蛋白7(bmp-7)的试剂盒、疫苗、原料药、中间体或相关制剂等，获得的相应产品皆取得了预期的效果。

本发明的有益效果

1、本发明u2-os表达系统具有快速增殖及高效的翻译后修饰系统的特性，可广泛用来表达人源蛋白、人源抗体、天然构象复杂的多聚体的糖蛋白或磷酸化蛋白等，表达产物可用于结构和功能研究。

2、本发明所用的信号肽可用于在u2-os中分泌表达hbmp-7等人源蛋白、人源抗体、生物活性肽等蛋白。

3、本发明表达系统表达的hbmp-7是其活性形式二聚体糖蛋白，能分泌表达，产量较高，有潜在的经济效益。

4、本发明表达系统可用于构建和表达病毒表面抗原，表达产物可作为蛋白免疫原，构建候选亚单位疫苗，有潜在的远期社会和经济效益。

5、本发明制备方法简单、效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

图1是重组表达载体rhb7-hbmp-7-pcdna3.1的构建流程图；

图2是重组表达载体rhb7-hbmp-7-pcdna3.1的sali酶切验证图；

图3、4是人骨肉瘤u2-os细胞表达的hbmp-7的westernblot验证图；

图5是人骨肉瘤u2-os细胞表达的hbmp-7的糖基化验证图。

图6是人骨肉瘤u2-os细胞表达的hbmp-7的elisa验证图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：

实施例1hbmp-7在人骨肉瘤u2-os细胞中的表达

本实施所述的hbmp-7自身信号肽基因序列：

seqidno:1

atgcacgtgcgctcactgcgagctgcggcgccgcacagcttcgtggcgctctgggcacccctgttcctgctgcgctccgccctggcc

本实施所述的hbmp-7自身信号肽氨基酸序列

seqidno:2

mhvrslraaaphsfvalwaplfllrsala

本实施所述的hbmp-7成熟肽基因序列

seqidno:3

tccacggggagcaaacagcgcagccagaaccgctccaagacgcccaagaaccaggaagccctgcggatggccaacgtggcagagaacagcagcagcgaccagaggcaggcctgtaagaagcacgagctgtatgtcagcttccgagacctgggctggcaggactggatcatcgcgcctgaaggctacgccgcctactactgtgagggggagtgtgccttccctctgaactcctacatgaacgccaccaaccacgccatcgtgcagacgctggtccacttcatcaacccggaaacggtgcccaagccctgctgtgcgcccacgcagctcaatgccatctccgtcctctacttcgatgacagctccaacgtcatcctgaagaaatacagaaacatggtggtccgggcctgtggctgccac

本实施所述的hbmp-7成熟肽氨基酸序列

seqidno:4

stgskqrsqnrsktpknqealrmanvaensssdqrqackkhelyvsfrdlgwqdwiiapegyaayycegecafplnsymnatnhaivqtlvhfinpetvpkpccaptqlnaisvlyfddssnvilkkyrnmvvracgch

本实施所述的6×his纯化标签的基因序列

seqidno:5

caccaccaccaccaccac。

一、癌细胞重组表达载体(rhb7-hbmp-7-pcdna3.1)的构建

1、目的基因序列的设计及合成

hbmp-7成熟肽基因序列5’端添加其自身信号肽基因序列，并在信号肽基因序列5’端添加hindiii酶切位点，hbmp-7成熟肽基因序列3’端添加6χhis标签及bamhi酶切位点。设计后的人hbmp-7基因(rhb7-hbmp-7)序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，设计后的rhb7-hbmp-7基因序列seqidno:6如下：

aagcttatgcacgtgcgctcactgcgagctgcggcgccgcacagcttcgtggcgctctgggcacccctgttcctgctgcgctccgccctggcctccacggggagcaaacagcgcagccagaaccgctccaagacgcccaagaaccaggaagccctgcggatggccaacgtggcagagaacagcagcagcgaccagaggcaggcctgtaagaagcacgagctgtatgtcagcttccgagacctgggctggcaggactggatcatcgcgcctgaaggctacgccgcctactactgtgagggggagtgtgccttccctctgaactcctacatgaacgccaccaaccacgccatcgtgcagacgctggtccacttcatcaacccggaaacggtgcccaagccctgctgtgcgcccacgcagctcaatgccatctccgtcctctacttcgatgacagctccaacgtcatcctgaagaaatacagaaacatggtggtccgggcctgtggctgccaccaccaccaccaccaccactagggatcc

2、rhb7-hbmp-7-pcdna3.1的构建及验证

将rhb7-hbmp-7基因片段及质粒pcdna3.1分别用hindiii和bamhi酶切，纯化酶切后的rhb7-hbmp-7基因及质粒pcdna3.1并用t4dnaligase连接，连接液转化大肠杆菌dh5α。挑取转化子并提取质粒进行验证。重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1经酶切及测序验证。重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1经sali酶切后产生两个线性片段(图1)。将含有验证正确的重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1的大肠杆菌扩大培养，用无内毒素质粒提取试剂盒(天根)提取质粒。所提质粒用于后续的细胞转染实验。

二、融合蛋白的表达

1、真核细胞转染实验

将人骨肉瘤u2-os细胞(市售)以4×10⁴个/孔的密度铺于24孔板内，分为阴性对照组；pcdna3.1组；rhb7-hbmp-7-pcdna3.1组。置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。至细胞生长面积为孔板底面积的85％-90％时，阴性对照组(u2-os细胞不加入质粒，其它步骤相同)，pcdna3.1组将1000ngpcdna3.1质粒转染至u2-os细胞内，rhb7-hbmp-7-pcdna3.1组将1000ngrhb7-hbmp-7-pcdna3.1重组质粒转染至u2-os细胞内，所用的转染试剂为lipofectamine2000(购自美国invitrogen)，转染操作步骤参考试剂说明书。

2、表达产物的收获

转染后48h，换为含有400μg/mlg418(gibco)的培养基筛选，直到阴性对照组细胞全部死亡。将1ml人骨肉瘤u2-os细胞培养上清转移至2.0ml离心管内，3000×g离心5min，弃去细胞碎片，将离心上清分装于2ml离心管中，于-20℃保存。用pbs缓冲液洗涤细胞层，胰酶(碧云天)消化并收获细胞沉淀。向细胞沉淀中加入20μlripa(碧云天)裂解细胞，4℃10000×g离心30min，将离心上清转移至2ml离心管中，于-20℃保存。

三、表达产物中hbmp-7蛋白的检测

1、sds-page电泳

向20μl收获的细胞裂解产物或细胞上清中加入4μl6×loadingbuffer(0.35mtris-hclph6.8，30％甘油，10％sds，0.012％溴酚蓝，6％β-巯基乙醇)，充分混匀，100℃煮沸5min后，4℃8000×g，离心10min，根据bca试剂盒(碧云天)测得的蛋白浓度，取使蛋白上样量每孔为20μg的上清加载至12％sds-page凝胶中，60v电泳5min，100v、10min，150v跑完。细胞裂解产物以gapdh为内参照调整样品上样量。

2、westernblotting

电泳结束后，将蛋白质转印至pvdf膜上，用5％脱脂奶粉于37℃封闭2h。封闭后的pvdf膜与兔抗bmp7多克隆抗体(1:1000，购自raybiotech)于4℃过夜孵育，再与辣根过氧化物酶(hrp)标记的山羊抗兔igg于37℃孵育1h。加入过氧化物酶底物，显示蛋白条带。

3、验证糖基化

对收获的细胞裂解产物用糖苷内切酶endoh(neb)处理，步骤按试剂说明书操作。再按照westernblotting步骤进行检测。

4、elisa

用pbs缓冲液洗涤细胞层，胰酶消化并收获细胞沉淀。向细胞沉淀中加入200μlripa(碧云天)裂解细胞，4℃10000×g离心30min，将离心上清转移至2ml离心管中。elisa操作步骤参考试剂盒(bio-swamp)说明书。

4、alp活性检测

取对数生长期细胞，按1×10⁵/ml的密度稀释细胞并加入到96孔细胞培养板中，每孔100μl，24h后细胞贴壁，吸去未贴壁死细胞和碎片，更换培养液，加入不同浓度rhbmp-7，使稀释后浓度分别为60μg/ml、0.6μg/ml、6μg/ml、60ng/ml、6ng/ml，加上阴性对照组(加入不含rhbmp-7的培养基)，培养48h，加入0.5％tritonx-100(1mtris-hcl，tritonx-100)40μl，以便于彻底裂解，4℃，2h。测定alp活性，按碱性磷酸酶试剂盒步骤操作(南京建成)。

实验结果如图3-图6所示。

图3是细胞裂解液中hbmp-7蛋白的westernblot鉴定图，以gapdh为内参照。其中control为u2-os细胞，b7为带hbmp-7自身信号肽的重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，sp为带人纤溶酶原信号肽的重组质粒rhsp-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，m9为带人基质金属蛋白酶-9信号肽的重组质粒rhm9-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞。图3b是对3a显影条带的灰度值分析。图3结果表明带hbmp-7自身信号肽的细胞中hbmp-7蛋白表达量最高。

图4是细胞培养液中hbmp-7蛋白的westernblot鉴定图，以gapdh为内参照。其中control为u2-os细胞，b7为带hbmp-7自身信号肽的重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，sp为带人纤溶酶原信号肽的重组质粒rhsp-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，m9为带人基质金属蛋白酶-9信号肽的重组质粒rhm9-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞。图4b是对4a显影条带的灰度值分析。图4结果表明hbmp-7自身信号肽分泌hbmp-7蛋白的效率最高。

图5糖苷内切酶(endoh)处理hbmp-7westernblot鉴定图，control为没有经过endoh处理的hbmp-7，endoh为经endoh酶切后的hbmp-7。图5结果表明u2-os对表达的hbmp-7进行了糖基化修饰。

图6是elisa分析不同细胞中hbmp-7蛋白表达量。图6a是hbmp-7在细胞裂解液中的表达量。其中control为u2-os细胞，b7为带hbmp-7自身信号肽的重组质粒rhb7-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，sp为带人纤溶酶原信号肽的重组质粒rhsp-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞，m9为带人基质金属蛋白酶-9信号肽的重组质粒rhm9-hbmp-7-pcdna3.1稳定转染u2-os的细胞。图6b是hbmp-7在培养液中的表达量。图6elisa结果表明hbmp-7自身信号肽分泌hbmp-7蛋白的效率最高，带hbmp-7自身信号肽的细胞中hbmp-7蛋白表达量最高。

收集带hbmp-7自身信号肽的细胞培养液，经highaffinityni-chargedresin(genscript)纯化，得到hbmp-7的量为28.3mg/l与4.5mg/l(j.c.bustos-valenzuela·e；2010)提高了6倍左右。

alp活性测试结果显示6ng/ml的hbmp-7组具有活性与之前cho表达的hbmp-7最低活性浓度10ng/ml(lixiao-yan；2005)所需浓度低。活性结果表明：本发明细胞培养液中hbmp-7蛋白的活性高于哺乳动物或微生物作蛋白表达体系获得的重组蛋白活性。

实施例2hbmp-7重组腺病毒载体在人骨肉瘤u2-os细胞中的表达

hbmp-7成熟肽基因序列5’端添加其自身信号肽基因序列，并在信号肽基因序列5’端添加noti酶切位点，hbmp-7成熟肽基因序列3’端添加6χhis标签及hindiii酶切位点。设计后的人hbmp-7基因(rhb7-hbmp-7)序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将合成后的基因序列经noti和hindiii双酶切后接入pshuttle-cmv穿梭载体，构建重组腺病毒的穿梭质粒pshuttle-hbmp7。ecori酶切pshuttle-hbmp7，并与padeasy^tmdna电穿孔共转化bj5183感受态细胞，抽提重组adbmp7质粒，paci酶切线性化重组质粒adbmp7后，转染ad293细胞进行病毒包装和扩增，腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度。用adbmp7感染骨肉瘤u2-os细胞，以elisa和westernblot法检测hbmp-7在u2-os细胞中的表达，糖苷内切酶(endoh)检测表达产物hbmp-7的糖基化状态，alp试剂盒检测hbmp-7的活性。实验结果表明，hbmp-7重组腺病毒载体能在人骨肉瘤u2-os细胞中高效表达，且表达产物具有糖基化，alp活性高于哺乳动物或微生物作蛋白表达体系获得的重组蛋白活性。

实施例3hbmp-2在人骨肉瘤u2-os细胞中的表达

用hbmp-2的氨基酸序列替代hbmp-7的氨基酸序列，hbmp-2的氨基末端加上hbmp-7的信号肽，并在信号肽基因序列5’端添加hindiii酶切位点，羧基末端添加6χhis标签及bamhi酶切位点。分别构建的重组表达载体rhb7-hbmp-2-pcdna3.1重组表达载体及重组腺病毒病毒表达载体adbmp2皆可在人骨肉瘤u2-os细胞中表达，且表达产物为糖基化状态，alp活性高于哺乳动物或微生物作蛋白表达体系获得的重组蛋白活性。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。