技术领域：
本发明涉及一种木糖异构酶基因，具体涉及来自瘤胃真菌的木糖异构酶基因及其转化木糖为木酮糖的功能，本发明还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备乙醇和其他发酵产物的应用。
背景技术：
：
将木质素纤维素以产业化方式生产乙醇是既经济又环保的方式。因为来自植物的木质纤维素原料是可以大量获得的可再生资源。但是许多能够发酵生产乙醇的酵母(如酿酒酵母)并不能以木糖作为碳源。因此，需要提供能够利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的酵母。
酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，酿酒酵母就可以代谢木酮糖生成乙醇等产物，木糖就可以作为碳源进行乙醇发酵。如果能够有效地将木糖发酵为乙醇，能使木质纤维素乙醇发酵的产量在原有的基础上增加25％，纤维乙醇生产成本将会降低20％左右。所以木糖发酵产乙醇已成为决定木质纤维素生产乙醇的经济可行的关键因素之一。
木糖异构化所需的木糖异构酶(d-xyloseisomerase，xi，ec5.3.1.5)催化五碳糖d-木糖转化为d-木酮糖，广泛存在于细菌、少部分真菌中。酿酒酵母具有木酮糖代谢的完整酶系，木酮糖进入磷酸戊糖途径，发酵生成乙醇。如果发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，酿酒酵母就能够将木糖异构化成木酮糖，达到可利用木糖作为碳源进行乙醇发酵的目的。
现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。曾有人分别克隆表达了多种来源的木糖异构酶基因，如escherichiacoli，bacillussubtilis，thormotogaspecies，thermusspecies等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在乙醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30℃左右的乙醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。
技术实现要素：
本发明的目的是从真菌中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。
本发明所要解决的技术问题如下：
从真菌中筛选出一种新的木糖异构酶基因；
提供包含上述木糖异构酶及其基因的重组载体；
提供包含上述木糖异构酶基因的重组菌株；
将所得上述重组菌株应用于转化木糖生成木酮糖，进而生成乙醇。
本发明人从天然瘤胃真菌中获得了一种新的木糖异构酶，命名为xi，并得到了一种编码该酶的木糖异构酶基因xyla，实验证明，该基因具有将木糖转化成木酮糖的功能，适合于在能源、酿酒以及食品工业中使用。
虽然本发明最初是通过筛选到该真菌完成的发明，但本发明的结果是得到了基因序列。他人不依赖这种真菌，只要得知序列就可以获得本发明的木糖异构酶。
所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。该xyla基因编码的木糖异构酶xi的氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明将上述木糖异构酶基因xyla插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，得到包含木糖异构酶基因xyla的重组质粒。所述表达载体优选为酿酒酵母多拷贝组成型表达载体pyes-fba，得到重组质粒pyes-fba-xi。
作为本发明的一个最优选的实施方案，所述表达载体合适的限制性酶切位点之间是质粒pyes2上的speⅰ和xbaⅰ限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于fba1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pyes-fba-xi。
本发明将上述重组酵母表达质粒pyes-fba-xi转化进入宿主细胞，得到可以高效表达上述木糖异构酶的重组菌株。
所述宿主细胞为酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选宿主细胞为酿酒酵母细胞(saccharomycescerevisiae)，更优选的，是将重组酵母表达质粒转化酿酒酵母t1308-u，得到重组菌株b1(详见实施例4)。
本发明还提供了包含上述木糖异构酶基因的重组菌株，优选为重组菌株b1。重组菌株b1能够高效表达上述木糖异构酶，该酶可用于发酵含有木糖的物质，将木糖转化成木酮糖，进而代谢生成乙醇和其他发酵产物。
本发明还提供了一种所得木糖异构酶的应用，包括以下步骤：
1、用权利要求重组质粒转化宿主细胞，得到重组菌株b1(详见实施例4)；
2、培养重组菌株b1，表达重组木糖异构酶。
其中，本发明的木糖异构酶具有以下应用范围：
1、能源工业：
可以将木质素纤维素水解物中大量存在的的d-木糖转化为d-木酮糖，而d-木酮糖又可被传统的乙醇生产菌株如酿酒酵母转化成有价值的燃料。
2、食品工业
木糖异构酶可以在体外催化d-葡萄糖转化为d-果糖，因此又被称为“葡萄糖异构酶”。这后一种活性在工业中可用于生产果葡糖浆，可作为食品添加剂。果葡糖浆是一种完全可以替代蔗糖的产品，并与蔗糖一样可广泛应用在食品及饮料行业。
具体实施方式
以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本发明的精神和思路。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：酿酒酵母表达载体pyes2购自invitrogen公司，酿酒酵母菌株t1308-u及大肠杆菌dh5α由所在实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶及连接酶购自neb公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
①大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、l％nacl，ph7.0)
②酵母培养基ypd(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)
③选择培养基sc(0.67％ynb、2％葡萄糖，平板添加2％琼脂)
实施例1瘤胃真菌基因组总dna的提取
①取瘤胃真菌菌株约0.5g，在液氮中迅速研磨成粉；
②加入4ml提取液，快速振荡混匀；
③加入等体积的4ml的氯仿：异戊醇(24：1)，涡旋3-5min；
④10000rpm，4℃，5min；
⑤上清用体积的氯仿：异戊醇(24：1)再抽提一次(10000rpm，4℃离心5min)；
⑥取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀，混匀，静置约30min；
⑦用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75％乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500μlte中；
⑧加入1μlrnasea(10mg/ml)，37℃处理1h；
⑨用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿：异戊醇(24：1)各抽提1次(10000rpm，4℃离心5min)；
⑩取上清，1/10v体积的3mnaac，2.5v体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上。12000rpm，4℃离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗，风干，溶于200μlph8.0的ddh2o中，-20℃保存备用。
实施例2瘤胃真菌木糖异构酶基因xyla的克隆
以实施例1提取的瘤胃真菌总dna为模板，进行pcr扩增。扩增得到产物回收后送上海生工生物公司测序，通过比对分析测序序列，证实获得的序列包含木糖异构酶全长基因序列，总长1284bp，序列如seqidno.2所示、
实施例3木糖异构酶基因表达载体质粒的构建
用编码瘤胃真菌木糖异构酶的基因的5’和3’端序列设计引物，包括ecorⅰ和xbaⅰ位点。用ecorⅰ和xbaⅰ酶切pcr产物。终产物被克隆到由pyes2产生的载体上。在该载体中，pyes2上的gal1启动子用fba1启动子替换来确保木糖异构酶的组成型表达，从而消除培养基中对半乳糖的需求。fba1启动子从酿酒酵母基因组克隆得到。该启动子被酶切成nheⅰ-ecorⅰ片段。fba1启动子和木糖异构酶的编码基因的pcr产物都被连接到用ecorⅰ和xbaⅰ剪切的pyes2上，最终得到含木糖异构酶基因的重组质粒pyes-fba-xi。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒的转化
1、感受态细胞的制备(氯化钙转化法)
①从活化的大肠杆菌(e.coli)dh5α平板上挑取单菌落接种到含5ml的lb液体培养基的试管中，37℃振荡培养2.5h至3h使菌液的od600值达到0.4至0.6，冰上冷却培养物至0℃；
②将培养物倒入无菌的1.5ml的离心管中；
③4℃，4000rpm离心10min；
④弃上清，收集菌体；
⑤用预冷的0.5ml的0.1m的cacl2重悬菌体，离心，弃上清；
⑥用预冷的0.5ml的0.1m的cacl2重悬菌体，冰浴15min，离心，弃上清；
⑦加入200μl的预冷的0.1m的cacl2重悬菌体，冰浴放置。
2、质粒转化感受态细胞
①取0.5μl质粒加于一管感受态细胞中，轻轻旋转以混匀内容物，冰上放置30min；
②将离心管置于42℃水浴中热激90s，不要晃动离心管；
③迅速将离心管置于冰上，冷却2min；
④加入800μl的lb液体培养基，37℃，200rpm摇床培养45min；
⑤取50μl的培养液涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)的lb固体平板上，37℃培养12至16小时，检查转化菌落；
⑥挑选单菌落，接种到含5ml的lb液体培养基的试管中，37℃振荡培养提取质粒酶切验证为正确的转化子，然后测序证明含有木糖异构酶基因。
实施例4工程菌株的构建
将含木糖异构酶基因的重组质粒pyes-fba-xi经电击转化法转入不具将木糖转化为木酮糖能力的酿酒酵母t1308-u中，在以2％葡萄糖作为碳源的sc培养基平板上筛选转化子。未被转化的细胞不能在这些平板上生长。pcr鉴定证明b1转化子含有带瘤胃真菌木糖异构酶基因的质粒。
酿酒酵母感受态细胞的制备及质粒的转化：
1、酵母感受态细胞的制备(电击转化法)
①在含5mlypd的50ml离心管中，培养酿酒酵母，30℃过夜；
②取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2l摇瓶，过夜生长至od600＝1.3-1.5；
③在4℃，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
④如上离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞；
⑤如上离心，用20ml预冷的1m山梨醇悬浮细胞；
⑥如上离心，用1ml预冷的1m山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml；
注意：可冻存80μl等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2、质粒电击转化感受态细胞：
①取80μl上述细胞与5-20μg线性化dna(溶于5-10μlte)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
②在冰上放置5min；
③根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击；
④立即加入1ml预冷的1m山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
⑤分成200-600μl等份，涂于sc平板上；
⑥在30℃孵育平板至克隆产生，pcr鉴定证明转化子b1含有带瘤胃真菌木糖异构
酶基因的质粒pyes-fba-xi。
实施例5工程菌株木糖异构酶酶活的测定
1、实验对象
实验菌株：含载体pyes-fba-xi酿酒酵母重组菌株b1(详见实施例4)；
对照菌株：含pyes-fba载体的酿酒酵母菌株。
2、实验方法
在以葡萄糖/木糖的混合物为唯一碳源的衡化培养生长，分别测定对照菌株和含载体pyes-fba-xi酿酒酵母重组株b1的木糖异构酶酶活。酶活的测定按如下方法进行：
适当酿酒酵母细胞破碎后的上清液(通过od595测定调整为总蛋白量一致)100mmtris-hclph7.0缓冲液，10mmmgcl2，2usdh(山梨醇脱氢酶，roche公司)和0.15mmnadh(还原型烟胺酸腺嘌呤二核苷酸，roche公司)，混匀，500mm的木糖启动反应，30℃、340nm下检测nadh被氧化的量(即在340nm做时间扫描)。木糖异构酶(xi)的一个酶活单位(u)定义为每分钟转化1μmol底物。
3、具体操作过程
①分别挑取单菌落接种在20ml的sc培养液中，30℃200rpm摇培48h；
②1600g离心5min，弃上清，沉淀用10mmph7.5的potassium-phosphatebuffer(含2mmedta)洗两次；
③重悬于100mmph7.5的potassium-phosphatebuffer(2mmmgcl2和1mmdithiothreitol)；
④超声破碎，4℃36000g离心20min，上清用做酶活分析和总蛋白测定。
4、测定结果
对照菌株未测出木糖异构酶酶活；
含载体pyes-fba-xi酿酒酵母重组菌株b1的木糖异构酶酶活测定为0.95u/mg总蛋白。
5、结论
瘤胃真菌木糖异构酶基因编码的木糖异构酶在酿酒酵母中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。
实施例6工程菌株木糖利用的测定
1、实验对象
实验菌株：含载体pyes-fba-xi的酿酒酵母重组菌株b1(详见实施例4)；
对照菌株：含pyes-fba载体的酿酒酵母菌株。
2、实验方法
在以葡萄糖/木糖的混合物(初始浓度分别为20.0g/l和10.0g/l)为唯一碳源的衡化培养生长，30℃200rpm摇培48h，高效液相色谱法(hplc)测定上清葡萄糖和木糖含量，推算糖利用效率。
3、结果
测试结果显示：经过48h培养，重组菌株p培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率达到59.41％；对照菌株培养基的葡萄糖几乎完全利用完，木糖利用率仅达到2.19％。
4、结论
瘤胃真菌木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率大大高于对照菌株。
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
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