稳定高效表达重组人透明质酸酶CHO‑K1SP细胞株及其构建方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及一种稳定高效表达重组人透明质酸酶的CHO-K1SP细胞株。
背景技术：
：透明质酸(HA)主要发现于哺乳动物的结缔组织、皮肤、软骨中以及滑液中。透明质酸也是眼睛玻璃体的主要组成成分。在结缔组织中，与透明质酸相关的水合作用的水产生了组织之间的空间，从而为细胞运动和增殖创造了有利的环境。透明质酸在与细胞运动有关的生物学现象中发挥关键作用，这些细胞运动包括快速发育(rapiddevelopment)、再生、修复、胚胎发生、胚胎发育、伤口愈合、血管生成和肿瘤发生。透明质酸酶是一类特异性水解透明质酸的水解酶，广泛存在于真核生物和原核生物中，主要水解透明质酸，是一种重要的生理活性物质。在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复，以及正常细胞和肿瘤细胞增生。许多病理变化过程往往伴随着透明质酸酶和透明质酸的变化，暗示它们可能起着重要的作用。同时透明质酸酶也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。透明质酸酶有三大类:1.哺乳动物类型透明质酸酶(EC3.2.1.35)，其是内-N-乙酰氨基己糖苷酶，以四糖和己糖作为主要的终产物。它们具有水解和转糖苷酶活性，能够降解透明质酸和硫酸软骨素(CS)，尤其是C4-S和C6-S。2.细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)降解透明质酸，并不同程度地降解CS和DS。它们是内-P-N-乙酰氨基己糖苷酶，它们通过P消去反应发挥作用，主要产生二糖终产物。3.来自水蛭、其它寄生虫和甲壳类动物的透明质酸酶(EC3.2.1.36)，其是内葡糖醛酸酶，通过水解P1-3键产生四糖和己糖终产物。哺乳动物透明质酸酶可以进一步分为两组:中性活性(neutralactive)和酸性活性(acidactive)酶。在人基因组中有六种透明质酸酶样基因:HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALPl是假基因，HYAL3对任何已知的底物都没有显示出具有酶活性。HYAL4是软骨素酶(chondroitinase)，对透明质酸缺少活性。HYALl是原型酸性活性酶，酸性活性透明质酸酶，诸如HYALl和HYAL2在中性pH中缺少催化活性。例如，HYALl在体外pH4.5以上无催化活性(FrostetalAnalBiochemistry,1997)。HYAL2是酸性活性酶，在体外具有非常低的比活性。PH20/SPAM1是原型中性活性酶，它能够催化转糖基作用，因此，在水解HA的过程中也会形成六碳糖、二糖以及八碳糖。透明质酸水解酶作为一种药理活性物质在临床上用途广泛，应用的领域包括药物促渗剂、癌症、糖尿病、抗菌药物、婴幼儿用药和急救补液治疗。透明质酸酶传统用途是用来改善其他注射用药物的渗透和增加其他药物的组织渗透性和促进扩散或分散。最常见的应用是眼科手术和局部麻醉药物的快速渗透(如牙科)，小儿静脉点滴中无法找到血管时使用。透明明质酸酶在抗肿瘤方面的作用机理是恶性组织经透明质酸酶处理后粘多糖含量增加，有利于肿瘤细胞结合更多的抗癌药物。如它可以加强阿霉素对乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的复发率等。在临床实际应用上，与单克隆抗体配合皮下注射代替静脉点滴能增加抗体药物的生物利用度；在糖尿病治疗市场上，与胰岛素注射剂联用皮下注射，能促进胰岛素的吸收，降低胰岛素的使用量，降低低血糖的发生率。目前中国市售的透明质酸酶多系从动物(牛、羊)睾丸组织提取的，纯度低，杂蛋白含量较高，免疫原性较强。动物组织提取的透明质酸酶在临床应用中出现明显的不良反应，比如早期透明质酸酶于前房注射后发生严重的炎症反应和角膜损伤，可能为注射的透明质酸酶所含杂质引起。随着透明质酸酶在眼科应用的开展，其过敏反应的报道逐渐增多，严重限制了透明质酸酶在国内的市场。为了解决国内透明质酸酶纯度低，免疫原性强不适合人用的缺陷，我们通过基因重组技术，构建人源透明质酸酶表达质粒，通过CHO细胞在无血清的培养基中表达纯化获得透明质酸酶，不含任何动物源成分，没有潜在的致病危险，不易产生免疫和炎症反应，且其生产规模不受组织原料来源限制，必将替代动物组织提取的透明质酸酶，满足国内的巨大市场需要，带来巨大的经济效益。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效表达重组人透明质酸酶的CHO-K1SP细胞株，本发明的另一个目的是通过建立筛选获得具有稳定高效表达具有生物活性的重组人透明质酸酶CHO-K1SP细胞株的方法，建立一种表达和生产具有复杂结构和生物活性的重组蛋白质的技术平台。所述的技术平台通过利用无血清悬浮培养技术，可以省略已有技术的无血清驯化过程，不仅提高亚克隆成功率，而且还大大方便了重组蛋白质的下游纯化。其宿主细胞为经过无血清悬浮驯化的CHO-K1SP。上述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤:(I)人工合成如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，插入到pGenHT1.0载体的多克隆位点，得到重组质粒，(2)将质粒转入无血清悬浮驯化的CHOk1sp的中(3)在CD-CHO+msx筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞，(4)采用有限稀释法挑选单克隆细胞株，采用Dotblot法检测和筛选阳性克隆，筛选得到高效表达的重组人透明质酸酶的CHO细胞株。用DNS法、浊度法和ELISA法检测细胞株培养上清的透明质酸酶的活性。一种CHO-K1SP细胞株，能高效表达重组人透明质酸酶。本发明还提供了一种CHO-K1SP细胞株的构建方法，包括以下几个步骤：步骤A：人工合成如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，插入到pGenHT1.0载体的多克隆位点，得到重组质粒；步骤B：将质粒转入无血清悬浮驯化的CHOk1sp的中；步骤C：在CD-CHO+msx筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞，步骤D：挑选单克隆细胞株，筛选得到高效表达的重组人透明质酸酶的CHO细胞株。优选的，所述步骤A包括以下几个步骤：步骤A1:rHuPH20基因的获得：查询UniProtKB数据库中人透明质酸酶(rHuPH20)的基因的序列，选取rHuPH20胞外的区域，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，对其核酸序列进行密码子优化，再进行全基因合成并连接到puc57载体上,构建puc57/rHuPH20重组质粒；步骤A2:pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒的获得：基于同源重组的方法构建载体，利用puc57/rHuPH20重组质粒PCR扩增rHuPH20片段，用HindIII和ECORI双酶切将pGenHT1.0在无菌EP管中加入rHuPH20的PCR产物，以及经HindIII和ECORI双酶切的pGenHT1.0载体片段，T4DNA聚合酶和T4缓冲液，反应后，将反应产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ于LB(Amp+)平板涂布培养，筛选阳性克隆转接到LB(Amp+)培养液中，过夜培养后利用小量快速提取试剂盒进行质粒提取，进行PCR鉴定。步骤A3:重组质粒的制备：采用提取pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒，经离心后，透析、沉淀、干燥和溶解后，保存备用。优选的，所述步骤D包括以下几个步骤：步骤D1：稳定转染:将CHO-K1SP细胞转染前按常规传代，接种后，转染，再将转染试剂和pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒DNA加入到OptiCHOTMSFM无血清培养基中，柔混匀，孵育，再将得到的质粒-转染试剂混合液缓慢且均匀的滴入到细胞培养瓶中，振荡培养；转染后，将细胞传代至细胞培养皿中，再继续传代后换成含筛选培养基进行筛选，待细胞活力和密度恢复后，对混合克隆细胞进行了克隆化，以获得高表达的单克隆细胞株；步骤D2：挑选单克隆：通过对悬浮细胞进行计数，将细胞进行一系列的稀释铺孔板上，再进行培养，取培养上清进行检测选取单克隆孔细胞，继续扩大培养,，待细胞密度合适时冻存细胞。本发明所建立的高效表达重组人透明质酸酶的CHO-K1SP细胞株，其中的5号单克隆细胞株培养上清中的rHuPH20表达量最高，达到1500U/ml。本发明的CHOK1-rHuPH20胞株，其宿主细胞是适应了无血清悬浮培养的已驯化CHOK1-rHuPH20，其与已有文献报道方法相比的优势在于:现有文献中所使用的表达重组蛋白的CHO细胞株需要在有牛血清或类似成分存在的情况下贴壁生长，细胞培养基中的血清或蛋白质成分对重组蛋白在细胞中的表达以及后期的蛋白纯化过程有很大的影响。因此，若产业化首先需要进行细胞株的无血清驯化，但在驯化程中会造成基因工程细胞株不稳定，导致蛋白表达量降低，而本发明使用已驯化好的适应无血清培养基的CHO-GS宿主细胞CHOK1SP，可以省略此步骤，有利于提高基因工程CHO细胞株的稳定性。此外，有血清培养中使用的动物血清或其它动物源性和/或人源性蛋白成分，不仅增加了生产成本，而且还增加了外源致病性微生物污染的机会，特别是克-雅氏病(即通常所说的疯牛病)病毒的污染。本发明中使用的无血清/无蛋白合成培养基不含任何动物源性和蛋白性成分，且细胞生长和产物表达水平与有血清培养基相当，其技术特点在于能支持细胞在大规模生物反应器中实现高密度培养，并有利于泡沫控制。本发明的CHO--k1sp系统是属于GS系统，相比于传统使用的DHFR-基因缺失CHO-DG44宿主细胞的基因扩增筛选系统，GS系统在细胞株筛选和生长过程中具有明显时间优势，因为GS系统可由最初的转染子形成高产细胞系，不需通过不断提高选择试剂浓度的多轮选择来实现基因扩增。并且CHO-K1SP比基因缺陷的CHIO-GS,CHO-DG44G更容易培养和强壮，培养基中不需要添加谷氨酰胺，能够避免谷氨酰胺分解造成培养体系中氨水平高的问题，降低了工艺控制的难度，有利于提高细胞发酵密度和延长细胞生存时间。附图说明图1是pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒的电泳图谱，其中1是pGenHT1.0/rHuPH20载体，2是pGenHT1.0/rHuPH20载体的MLUI和SalI双酶切，3是pGenHT1.0/rHuPH20载体的HindIII和EcorRI双酶切。图2是SDS-PAGE法检测阳性克隆细胞培养上清中重组人透明质酸酶的分泌表达。图3是Westernblot法检测阳性克隆细胞培养上清中重组人透明质酸酶的分泌表达。图4是表达重组人透明质酸酶的细胞株的Dotblot筛选图。具体实施方式下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：实施例1pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒的构建rHuPH20基因的获得：查询UniProtKB数据库中人透明质酸酶(rHuPH20)的基因的序列，选取rHuPH20胞外的区域，氨基酸序列如SEQIDN0.1所示，对其核酸序列进行密码子优化，委托南京金斯瑞生物技术有限公司进行全基因合成并连接到puc57载体(genscript公司)上,构建成功puc57/rHuPH20重组质粒。pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒的获得如图1所示，基于同源重组的方法构建载体，利用puc57/rHuPH20重组质粒PCR扩增rHuPH20片段，用HindIII和ECORI双酶切将pGenHT1.0在无菌EP管中加入4ulrHuPH20的PCR产物和1ug经HindIII和ECORI双酶切的pGenHT1.0载体片段，0.5ulT4DNA聚合酶，4ulT4缓冲液，加双蒸水补足至20ul，于室温反应30min。将反应产物转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，LB(Amp+)平板涂布培养，筛选阳性克隆转接到LB(Amp+)培养液中，过夜培养后利用小量快速提取试剂盒进行质粒提取，进行PCR鉴定。委托南京金斯瑞生物技术有限公司对重组质粒进行测序确认，最终获得.pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒。1.3重组质粒的大量制备采用碱裂解法大量提取pGenHT1.0/rHuPH20重组质粒，经氯化铯密度梯度离心后，回收超螺旋状态质粒，经透析、沉淀、干燥和溶解后，于-20℃保存备用。实施例2获得表达重组人透明质酸酶rHuPH20的CHO-K1SP细胞株2.1稳定转染CHO--k1sp细胞转染前按常规传代，以3XIO5细胞/ml密度接种于含有30ml培养液的125ml无菌三角瓶中，使次日细胞密度能达到5XIO5活细胞/ml，转染步骤按Invitrogen公司的FreeStyleTMMAX转染试剂说明书进行。将15μlFreeStyleTMMAX转染试剂和9μgpGenHT1.0/rHuPH20重组质粒DNA加入到1.2mlOptiCHOTMSFM无血清培养基中，轻柔混匀，室温孵育lOmin。将1.2ml质粒-转染试剂混合液缓慢且均匀的滴入到细胞培养瓶中，置CO2培养箱振荡培养。转染24h后，按照1:10的比例将细胞传代至150mm细胞培养皿中，传代24h后换成含有25uMmsx的筛选培养基进行筛选，维持压力筛选培养四周，待细胞活力和密度恢复后，采用有限稀释法对混合克隆细胞进行了克隆化，以期获得高表达的单克隆细胞株。2.2利用有限稀释法挑选单克隆通过对悬浮细胞进行计数，将细胞进行一系列的稀释至5个/ml，再以每孔200μI的细胞悬液铺96孔板，在37℃、体积浓度5％CO2的条件下培养两周，取培养上清进行dotblot检测。根据检测结果，选取表达量高的单克隆孔细胞，转入24孔板扩大培养,培养3-7天后转入6孔板扩大培养，再转到T25和125ml摇瓶扩大培养，待细胞密度合适时冻存细胞。2.3Dotblot方法挑选阳性单克隆Dotblot方法是收集细胞培养液上清作为样品，点膜，使用PVDF膜(需泡甲醇)，按照样品顺序点膜，5ul/点，空细胞培养液作为阴性对照，用圆珠笔做好标记，将膜置于37℃烘干，约10-15min；封闭，用TBST配制5％脱脂奶粉，室温摇床封闭1h；TBST洗涤1-2次；一抗(TBST配制)孵育1h；TBST洗涤三次，每次10min；二抗(TBST配制)孵育1h；TBST洗涤三次，每次10min；ECL显影,结果如图4所示，一共筛选到30个阳性单克隆，挑选表达量高的10个单克隆进行放大培养，冻存细胞作为CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株。实施例3鉴定rHuPH20在CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株的细胞培养物中的表达选择了表达量前几位的阳性克隆的培养上清进行SDS-PAGE及Westernblot检测。方法是：收集细胞培养液上清，加入相应量的Loadingbuffer，煮沸5min；SDS-PAGE电泳；转膜，电泳完后，将胶小心剥下，与滤纸、纤维垫、硝酸纤维膜按正确顺序装好，-20℃浸泡于转移缓冲液40min；装好转移电泳盒，放入转子、冰盒，接好电源，在磁力搅拌器上100V恒压转移lh；转移完成后拆去转移装置，揭下膜，标记好正反面(膜与胶贴着的一面为正面)，放入丽春红染液染色5-10min，取出，去离子水洗去浮色，观察转移效果，丽春红染色可做可不做；加入封闭液，4℃过夜，或室温lh；TBST洗膜1-2次；用TBST稀释一抗，置于水平摇床上室温孵育lh；TBST洗涤三次，每次10min；用TBST稀释二抗，置于水平摇床上室温孵育lh；TBST洗涤三次，每次10min，ECL显色。SDS-PAGE电泳图见图2，10株工程细胞株在60KD附近出现阳性条带，与预测结果一致。Westernblot结果如图3所示，10株工程细胞株在60KD附近出现阳性条带，与预测结果一致，糖基化的rHuPH20的分子量是66KD。试验结果表明成功构建表达rHuPH20的CHO-K1SP工程细胞株。实施例4检测培养上清中rHuPH20的生物活性DNS在碱性溶液中被haase降解ha产物中的还原糖还原为氨基化合物，沸水浴中显色时间5min，冷却后立即测定540nm处的吸光度A540。0.5ml0.5％的HA溶液与0.5ml样品液混合，37水浴30min，煮沸5min停止反应，离心沉淀变性蛋白，取上清液0.4ml，加0.8mlDNS溶液。DNS被HAase降解HA产物中的还原糖还原为氨基化合物，煮沸5min使之充分显色，冷却后立即测定。空白组以磷酸盐缓冲液代替样品液。10株CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株培养一周后，分别提取培养液上清，稀释50倍用DNS法测定HAase的活性，结果见表1。CHO-K1SP细胞作为阴性对照，未检测到HAase的活性。结果如表1所示，10株CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株的酶活表达量均大于1000U/ml,最高达到1500U/ml以上。实施例5CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株分泌rHuPH20的动态观察及稳定性分析对10株CHO-K1SP-rHuPH20工程细胞株分泌rHuPH20的动态进行了观察，如图3所示，细胞株在撤去MSX压力条件下传代60代后，仍能稳定分泌rHuPH20，表明经筛选得到的高效表达rHuPH20的CHO-K1SP细胞株是比较稳定的，具有商业化价值。表1细胞株ID透明质酸酶活性(单位/ml)281090133150079110014014052515106513854111251315711275181145SEQIDNo1：rHuPH20氨基酸序列MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYSEQIDNO2：rHuPH20优化后核酸序列ATGGGCGTGCTGAAGTTCAAGCACATCTTCTTCCGGTCCTTCGTGAAGTCCTCCGGCGTGTCCCAGATCGTGTTTACCTTCCTGCTGATCCCCTGCTGCCTGACCCTGAACTTTCGGGCCCCTCCCGTGATCCCCAACGTGCCATTTCTGTGGGCCTGGAACGCCCCCTCCGAGTTCTGTCTGGGCAAGTTCGACGAGCCCCTGGATATGTCCCTGTTCTCCTTCATCGGCTCCCCCCGGATCAATGCTACCGGCCAGGGCGTGACCATCTTCTACGTGGACCGGCTGGGCTACTACCCCTACATCGACTCCATCACCGGCGTGACCGTGAACGGCGGCATCCCCCAGAAGATCTCCCTGCAGGACCACCTGGACAAGGCCAAGAAGGACATCACCTTCTACATGCCCGTGGACAACCTGGGCATGGCCGTGATCGACTGGGAGGAATGGCGGCCTACCTGGGCCAGAAACTGGAAGCCCAAGGACGTGTACAAGAACCGGTCCATCGAGCTGGTGCAGCAGCAGAACGTGCAGCTGTCTCTGACCGAGGCCACCGAGAAGGCTAAGCAGGAATTCGAGAAGGCCGGCAAGGACTTCCTGGTGGAAACCATCAAGCTGGGCAAGCTGCTGCGGCCCAATCACCTGTGGGGCTACTATCTGTTCCCCGACTGCTACAACCACCACTACAAGAAGCCCGGCTACAACGGCTCCTGCTTCAACGTGGAAATCAAGCGGAACGACGACCTGTCCTGGCTGTGGAACGAGTCCACCGCCCTGTACCCCTCCATCTACCTGAACACCCAGCAGAGCCCTGTGGCCGCCACACTGTACGTGCGGAACAGAGTGCGCGAGGCCATCAGAGTGTCCAAGATCCCCGACGCCAAGTCCCCCCTGCCTGTGTTCGCCTACACCCGGATCGTGTTCACCGACCAGGTGCTGAAATTCCTGAGCCAGGATGAGCTGGTGTATACCTTCGGCGAGACAGTGGCCCTGGGCGCCTCTGGAATCGTGATCTGGGGCACCCTGTCCATCATGCGGTCCATGAAGTCCTGCCTGCTGCTGGACAACTACATGGAAACAATCCTGAACCCTTACATCATCAACGTGACCCTGGCCGCCAAGATGTGTTCTCAGGTGCTGTGCCAGGAACAGGGCGTGTGCATCCGGAAGAACTGGAACTCCTCCGACTACCTGCACCTGAACCCCGACAACTTCGCCATTCAGCTGGAAAAGGGCGGCAAGTTCACCGTGCGGGGCAAGCCCACACTGGAAGATCTGGAACAGTTCTCCGAGAAGTTCTACTGCTCCTGCTACTCCACCCTGAGCTGCAAAGAAAAGGCCGACGTGAAGGACACCGACGCCGTGGACGTGTGTATCGCCGACGGCGTGTGTATTGACGCCTTCCTGAAGCCCCCCATGGAAACCGAGGAACCTCAGATCTTCTAC以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页1 2 3