效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法与流程

技术特征：

1.一种效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：包括下列步骤：

(一)引物设计

根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入Xho Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；

P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’

GGA TCC序列为BamH Ⅰ酶切位点；Tm＝56.84

P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’

CTC GAG序列为Xho Ⅰ酶切位点；Tm＝66.90；

(二)PCR扩增Bm‐myosin基因

P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mMdNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化

(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；

(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离心,8000rpm 5min；弃上清,加入冰浴的0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm5min,弃上清,加入冰浴的0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；

(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；

(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal、IPTG和Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；

(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定

(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；

(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCRBuffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamH Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；

(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；

(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测

分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；

(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测

采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；

(七)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测

(1)人源HLA Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLA Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果；

(2)鼠源MHC Ⅰ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHC Ⅰ类分子，预测MHC Ⅰ类分子结合肽，保留输出的结果；

(3)人源HLA Ⅱ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301和HLA‐DRB1*1501，预测HLA Ⅱ类分子结合肽，保留输出的结果；

(4)鼠源MHC Ⅱ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHC Ⅱ类分子结合肽，保留输出的结果；

(八)表位基因片段的选择

根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；

应用Primer 5软件设计引物；

上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’

其中下划线序列为BamH Ⅰ酶切位点；

下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT

其中下划线序列为EcoR Ⅰ酶切位点；

引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L；

(九)目的基因片段原核表达载体构建

A、菌种活化和扩增

(1)取保存于‐80℃的菌种，用接种环划菌于1.5％含Amp的琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；

(2)挑取单菌落，接种于4ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，220rpm振荡培养12‐14h；

B、pET‐28a(+)质粒小量抽提

(1)取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清；

(2)加250μl悬浮液Buffer S1充分悬浮细菌沉淀至无小菌块；

(3)加250μl裂解液Buffer S2，温和并充分地上下翻转4‐6次，使菌体充分裂解；

(4)加350μl中和液Buffer S3，温和并充分地上下翻转6‐8次，12000rpm离心10min；

(5)吸取步骤4中的上清，转移到制备管，12000rpm离心1min，弃滤液；

(6)向制备管中加500μl去盐液Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；

(7)向制备管中加700μl洗涤液Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复该步骤一次；

(8)将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min；

(9)将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管膜中央加60μl洗脱液Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；

C、表位基因片段PCR扩增

以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1；

表1 PCR扩增反应体系

扩增反应参数为：

取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因；

胶回收

(1)切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用面纸吸尽凝胶表面液体，放到1.5ml离心管中，用镊子夹碎；计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE‐A，75℃加热6‐8min，间断混合，直至凝胶块完全熔化；

(3)加入0.5个Buffer DE‐A体积的Buffer DE‐B，上下颠倒混合均匀；

(4)吸取步骤3中的溶液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；

(5)向制备管中加500μl Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；

(6)向制备管中加700μl Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液；再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1min；

(7)将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min；

(8)将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min，管中的溶液即为回收的DNA溶液；

D、目的基因与载体连接与鉴定

①PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系见表2

表2 双酶切反应体系

目的基因与载体连接，具体反应体系见表3；

表3 目的基因与载体连接反应体系

混匀，室温反应30min以上，产物用于转化；

②E.coli DH5α感受态细胞的制备

(1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养14‐16h至单菌落出现；

(2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养10‐12h；

(3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min；

(4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min；

(5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min；

(6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min；

(7)用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃；

③转化及鉴定

(1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动；

(3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min；

(4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min；

(5)5000rpm离心1min；

(6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h；

(7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间；

(8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应；

(9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定；

E、核酸序列测序鉴定:

选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序；

(十)rBmM29重组蛋白表达和纯化

A、rBmM29重组蛋白的诱导

将重组质粒pET‐BmM29转化至E.coli BL21，菌落PCR鉴定为阳性后，进行诱导表达：

(1)将含有重组质粒的BL21接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；

(2)将上述菌液1:100比例转种入100ml LB培养基，200rpm震荡培养至OD600达0.5‐0.8；

(3)加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃诱导12h；

(4)4℃，6000rpm离心10min收集细菌；

(5)加入10ml蛋白纯化结合缓冲液，重悬菌体；

(6)200W超声10min，中间间隔10min，再超声10min，至菌液变澄清；

(7)4℃，12000rpm离心20min，收集上清；

B、重组蛋白的纯化

(1)取1ml镍琼脂糖填料置于4ml结合缓冲液中，混匀，静置数分钟后，将上层液体用移液器吸掉；重复该操作1次；

(2)将菌体裂解后的上清与镍琼脂糖填料混合后放在冰中，置摇床上孵育1h；

(3)将上述混合物转移至柱子中，让液体流出；

(4)用4ml洗涤缓冲液洗去杂蛋白，重复该操作1次；

(5)用5ml洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱的蛋白；

(十一)BmM29表位基因真核表达载体构建

纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的克隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜。取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp(100mg/ml)平板上,37℃过夜培养。从LB‐Amp(100mg/ml)平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.根据权利要求1所述的效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：蛋白浓缩后，用紫外分光光度计测定在260nm波长的OD值。

3.根据权利要求1所述的效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：蛋白浓缩后，用紫外分光光度计测定在280nm波长的OD值。

4.根据权利要求1所述的效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗制备方法，其特征是：计算蛋白质含量mg/ml＝(1.45×A280‐0.74×A260)×稀释倍数。