技术领域
本发明涉及一种周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法。
背景技术：
丝虫病是全世界重点控制的一种严重危害人类健康的疾病。为全球致残的第二大病因。据WHO报告，全球有83个国家和地区共有淋巴丝虫感染者约1.2亿。这些感染者中约4400万有淋巴丝虫病的临床表现，约7600万为微丝蚴血症者。估计全球有受威胁人口超过11亿，约占世界总人口的20％。我国曾是全球淋巴丝虫病流行最严重的国家之一，受威胁人口达3.3亿。虽然丝虫病的防治在全球范围内取得了巨大的成绩，但由于气候变暖等自然、生物和社会以及淋巴丝虫的夜现周期性和微丝蚴血症者多无临床症状等诸多因素的广泛存在，近年来在一些国家和地区出现疫情复燃和蔓延的趋势，丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。抗丝虫感染的研究一直被世界各国专家学者所关注，如何抵御丝虫感染和侵袭，除药物和防蚊外，免疫预防已被视为一种重要的具有持效性的措施。研制有效的抗丝虫疫苗是摆在我们面前的重大课题。丝虫为多细胞人体寄生虫，生活史及抗原分子复杂，肌球蛋白作为生物体的一种重要的收缩蛋白质和抗原分子，有可能成为寄生虫疫苗和药物研究的重要靶分子。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种方法简便、效果好的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法。
本发明的技术解决方案是：
一种周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：
(一)引物设计
根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基；
P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’
下划线序列为BamHⅠ酶切位点 Tm＝56.84
P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’
下划线序列为XhoⅠ酶切位点 Tm＝66.90；
(二)PCR扩增Bm‐myosin基因
P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；1℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；同时设立阴性对照；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(三)Bm‐myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化
(1)纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物；
(2)感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜；挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜；取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离,8000rpm 5min；弃上清,加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm 5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用；
(3)Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h；
(4)转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min；将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养；
(四)阳性重组克隆的筛选和鉴定
(1)阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒；
(2)PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul；循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(3)酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段；
(4)测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面测序；
(五)Bm‐MYOSIN二级结构预测
分别应用EXPASY服务器上的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构；
(六)Bm‐MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测
采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测；
(七)Bm‐MYOSIN T细胞表位预测
(1)人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；
(2)鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d，包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果；
(3)人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；
(4)鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果；
(八)表位基因片段的选择
根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段562bp‐1269bp设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29；
应用Primer 5软件设计引物；
上游P1：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’
其中下划线序列为BamHⅠ酶切位点；
下游P2：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
其中下划线序列为EcoRⅠ酶切位点；
引物使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L；
(九)目的基因片段原核表达载体构建
A、菌种活化和扩增
(1)取保存于‐80℃的菌种，用接种环划菌于1.5％含Amp的琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现；
(2)挑取单菌落，接种于4ml含Amp的LB液体培养基中，37℃恒温，220rpm振荡培养12‐14h；
B、pET‐28a(+)质粒小量抽提
(1)取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清；
(2)加250μl悬浮液Buffer S1充分悬浮细菌沉淀至无小菌块；
(3)加250μl裂解液Buffer S2，温和并充分地上下翻转4‐6次，使菌体充分裂解；
(4)加350μl中和液Buffer S3，温和并充分地上下翻转6‐8次，12000rpm离心10min；
(5)吸取步骤4中的上清，转移到制备管，12000rpm离心1min，弃滤液；
(6)向制备管中加500μl去盐液Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液；
(7)向制备管中加700μl洗涤液Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复该步骤一次；
(8)将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min；
(9)将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管膜中央加60μl洗脱液Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min；离心管中的溶液即为所抽提的质粒；
C、表位基因片段PCR扩增
以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1；
表1 PCR扩增反应体系
扩增反应参数为：
取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因；
胶回收
(1)切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用面纸吸尽凝胶表面液体，放到1.5ml离心管中，用镊子夹碎；计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；
(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE‐A，75℃加热约6‐8min，间断混合，直至凝胶块完全熔化；
(3)加入0.5个Buffer DE‐A体积的Buffer DE‐B，上下颠倒混合均匀；
(4)吸取步骤3中的溶液，转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(5)向制备管中加500μl Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液；
(6)向制备管中加700μl Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液；再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1min；
(7)将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min；
(8)将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl Eluent，室温静置1min；12000rpm离心1min，管中的溶液即为回收的DNA溶液；
D、目的基因与载体连接与鉴定
①PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系见表2
表2 双酶切反应体系
目的基因与载体连接，具体反应体系见表3；
表3 目的基因与载体连接反应体系
混匀，室温反应30min以上，产物用于转化；
②E.coli DH5α感受态细胞的制备
(1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养约14‐16h至单菌落出现；
(2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养约10‐12h；
(3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养约2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min；
(4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min；
(5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min；
(6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min；
(7)用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃；
③转化及鉴定
(1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；
(2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动；
(3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min；
(4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min；
(5)5000rpm离心1min；
(6)弃部分上清，混匀后倒在含Amp的LB平板上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h；
(7)用白枪头挑单克隆至5ml含Amp的LB液，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间；
(8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应；
(9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定；
E、核酸序列测序鉴定:
选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后进行测序；
(十)rBmM29重组蛋白表达和纯化
A、rBmM29重组蛋白的诱导
将重组质粒pET‐BmM29转化至E.coli BL21，菌落PCR鉴定为阳性后，进行诱导表达：
(1)将含有重组质粒的BL21接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；
(2)将上述菌液1:100比例转种入100ml LB培养基，200rpm震荡培养至OD600达0.5‐0.8；
(3)加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃诱导12h；
(4)4℃，6000rpm离心10min收集细菌；
(5)加入10ml蛋白纯化结合缓冲液，重悬菌体；
(6)200W超声10min，中间间隔10min，再超声10min，至菌液变澄清；
(7)4℃，12000rpm离心20min，收集上清；
B、重组蛋白的纯化
(1)取1ml镍琼脂糖填料置于4ml结合缓冲液中，混匀，静置数分钟后，将上层液体用移液器吸掉；重复该操作1次；
(2)将菌体裂解后的上清与镍琼脂糖填料混合后放在冰中，置摇床上孵育1h；
(3)将上述混合物转移至柱子中，让液体流出；
(4)用4ml洗涤缓冲液洗去杂蛋白，重复该操作1次；
(5)用5ml洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱的蛋白。
2.根据权利要求1所述的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法，其特征是：得到的蛋白还进行SDS‐PAGE分析：
(1)将胶垫和玻璃板安装固定好；
(2)按表2‐4配制10％分离胶3.75ml，加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间，再在胶液面上小心注入异丙醇；
(3)待凝胶聚合完全后，倾出覆盖的异丙醇，用滤纸将残留的异丙醇吸尽；
(4)另取一只烧杯，按表2‐5配制5％浓缩胶2.5ml，加入TEMED后立即快速旋动混合物，并倒入玻璃板中；
(5)立即将梳子插入到浓缩胶内，注意不要有气泡，将凝胶室温静置30min；
(6)取出梳子，将凝胶板固定于电泳装置的上缓冲液室，放到下缓冲液室中，向上下缓冲液室加入1×电泳缓冲液；
表4 分离胶组份配制表
表5 浓缩胶组份配制表
(7)上样：将蛋白质分子量标准参照物和样品依次上样；
(8)电泳：分离胶电压100V，电泳90min，浓缩胶电压80V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部；
(9)考马斯亮蓝染色：小心剥下分离胶凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，于摇床上摇动1‐2h；
(10)将凝胶转移到盛有脱色液的平皿中，于摇床上摇动，每15min换一次液，至背景无色，拍照观察结果；
蛋白浓度测定
蛋白浓缩后，用紫外分光光度计测定在260nm和280nm波长的OD值，计算蛋白质含量mg/ml＝(1.45×A280‐0.74×A260)×稀释倍数。
3.根据权利要求1所述的周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备方法，其特征是：还进行BmM29表位基因真核表达载体构建、BmM29表位基因蛋白疫苗免疫应答试验、免疫应答反应检测；
(一)BmM29表位基因真核表达载体构建
纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ的克隆位点；目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜；取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于的LB‐Amp平板上,37℃过夜培养；从LB‐Amp平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(二BmM29表位基因蛋白疫苗免疫应答试验
(1)免疫佐剂CpG ODN的制备
新型佐剂中以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核苷酸CpG ODN最具代表性；CpG ODN合成的序列如下：CpG ODN 1826 5′‐TCCATGACGTTCCTGACGTT‐3′，并全链硫代磷酸骨架修饰来增强其核酸酶抗性，用生理盐水溶解配制成1mg/ml；
(2)实验动物分组
将48只BALB/c实验小鼠称量体重排序，按照随机数字表法分4组，每组12只，A：PBS对照组；B：空载体pcDNA3.1(+)/CpG组；C：重组蛋白/CpG组；D：重组蛋白/重组质粒/CpG组，免疫方案为0、2、4周各免疫一次；
(3)接种部位预处理
DNA疫苗注射部位为小鼠后腿胫前肌，重组蛋白疫苗为皮下多点注射；将lml左旋盐酸布比卡因注射液稀释到14ml生理盐水中，得到0.5mg/ml稀释液；每次接种前24h，于接种部位注射左旋盐酸布比卡因50μl进行预处理
(4)免疫接种
A：PBS 100μl；B：pcDNA3.1(+)/CpG 100μg/30μg；C：rBmM29/CpG 50μg/30μg；D：前2次注射pcDNA3.1(+)‐BmM29/CpG 100μg/30μg，第三次注射rBmM29/CpG50μg/30μg；共免疫3次，每次间隔2周；
(三)免疫应答反应检测
A.血清采集：分别于初次免疫后4、6、8周用眼球摘除法收集小鼠血清，每组取4只小鼠；室温静置1h，置4℃过夜，待析出血清，4℃，4000rpm离心10min；分装血清，贮存于‐80℃；
B.免疫小鼠血清中IgG检测
(1)抗原包被：用抗原包被缓冲液将抗原稀释成5μg/mL，以100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；
(2)弃液体，用PBST洗涤3次；使用100μl/孔封闭液封闭，室温静置1h；
(3)弃液体，血清用抗体稀释液按照1:100比例稀释后，100μl/孔，室温2h；
(4)用PBST洗涤3次；
(5)用样品稀释液1:2000稀释HRP偶联的IgG抗体后，100μl/孔，室温1h；
(6)使用PBST洗涤3次；
(7)加入100μl/孔底物液，作用15min后，加50μl 2mol/L H2SO4终止反应；
(8)在450nm处测定吸光值，保存数据；
C.小鼠脾细胞采集
(1)初次免疫后8周处死小鼠；
(2)取无菌10ml螺口管，加入3ml淋巴细胞分离液，37℃预热2h；
(3)将处死的小鼠置75％乙醇溶液中2‐3min进行消毒；
(4)将小鼠左腹侧朝上，用镊子将小鼠左腹部皮肤轻轻提起，用手术剪剪出约1cm长刀口，用手将腹部皮肤撕开，暴露腹膜，可见红色长条状脾脏，将其小心分离；
(5)将100目铜筛放入盛3ml Hank′s液的平皿中，将脾脏放在铜筛上，先将脾脏撕碎，再用玻璃棒轻轻研磨，直至铜筛上只剩下结缔组织，再用3ml Hank′s液冲洗铜筛；
(6)将含3ml淋巴细胞分离液的螺口管倾斜45°，用滴管将平皿中的细胞悬液沿管壁缓慢转移，不要冲破淋巴细胞分离液的界面；
(7)室温2000rpm离心20min，管中液体分为4层；
(8)取白色的第2层，转移至含10ml Hank′s液的50ml离心管中，室温1000rpm离心10min；
(9)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，室温1000rpm离心10min；
(10)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，用计数板计数；
(11)室温1000rpm离心10min，弃上层液体，加入适量完全培养基使得细胞的终浓度为2×106cells/ml；
D.细胞因子的诱生
24孔板加入2×106cells/ml细胞悬液475μl/孔，每孔各加100μl/ml ConA 25μl至终浓度为5μg/ml，5％CO2培养箱中37℃孵育48h；5000rpm离心10min收集培养液，取上清准备检测；
E.INF‐γ和IL‐4含量测定
(1)提前20min取出保存在4℃的ELISA试剂盒，平衡至室温；
(2)将浓缩洗涤液用ddH2O稀释20倍；
(3)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，加入标准样品160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、0pg/ml各50ul；
(4)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，除空白孔外，分别加入样品稀释液40ul和待测样品10ul；
(5)除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min；
(6)弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
(7)每孔先加入显色剂A、B各50μl，37℃避光孵育15min；
(8)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
(9)计算OD值：每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值；
(10)绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应的OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线；
(11)通过样品的OD值可在标准曲线上查出该样品的浓度。
本发明以我国流行的周期型马来丝虫为对象，进行基因工程蛋白疫苗的研制。表位是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，在免疫应答中，抗原分子表面的B细胞表位和T细胞表位，分别被B、T细胞表面的BCR和TCR识别，从而诱导出高度特异性的体液免疫和细胞免疫，产生免疫效应。首先我们根据周期型马来丝虫肌球蛋白基因测序结果分析，推测其氨基酸序列，然后利用相关的软件进行B细胞表位和T细胞表位预测和筛选，构建周期型马来丝虫M29表位基因的原核与真核表达重组质粒。用IPTG诱导表达重组蛋白rBmM29，并进行纯化。将rBmM29免疫小鼠，检测其疫苗的体液免疫和细胞免疫的应答效果。试验结果证明了该蛋白疫苗可诱导小鼠产生特异性的免疫应答反应，取得满意效果，制备周期型马来丝虫肌球蛋白表位基因蛋白疫苗获得成功。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一、引物设计
根据GenBank中周期型马来丝虫肌球蛋白基因(Bm‐myosin)的高度保守序列区,应用Primer Premier5.0软件设计引物,并分别引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位点,起始终止密码以及保护性碱基，引物由上海生物工程公司合成。
P1:上游5’‐CC GGA TCC ATG AAA TGC AAA AAA T‐3’
下划线序列为BamHⅠ酶切位点 (Tm＝56.84)
P2:下游5’‐CC CTC GAG ATG GTG AAC GGA GTA CG‐3’
下划线序列为XhoⅠ酶切位点 (Tm＝66.90)
二、PCR扩增Bm-myosin基因
P1＝56.84,P2＝66.90,反应体系cDNA 1.5ul,10×PCR Buffer 2.5ul,2.5mM dNTPmix 4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O 15.4ul。混匀在DNA扩增仪PTC‐100上进行PCR。循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应。同时设立阴性对照。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
三、Bm-myosin基因片段纯化和T载体的连接以及转化
1.纯化Bm‐myosin基因片段:取50ulPCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下切割含目的基因的凝胶,按胶回收试剂盒说明,纯化回收产物。
2.感受态大肠杆菌的制备:大肠杆菌DH5α在新鲜LB琼脂平板上37℃培养过夜。挑取单菌落于3ml LB培养基中,37℃振荡过夜。取300ul菌液加入30ml LB培养基中,37℃220rpm振荡4h,冰浴1h,后分装到1.5ml Eppendorf管4℃离,8000rpm 5min。弃上清,加入冰浴0.1mol/L MgCl2 100ul悬浮,4℃离心,8000rpm 5min,弃上清,加入冰浴0.1mol/L CaCl2‐10％甘油溶液300ul悬浮,‐70℃保存备用。
3.Bm‐myosin基因和pGEM‐T载体的连接:取纯化的PCR产物3ul,2×快速连接缓冲液5ul,pGEM‐T载体(50ng)1ul,T4DNA连接酶3weiss/ul 1ul,共10ul混匀,4℃连接20h。
4.转化:取连接反应物10ul加入新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞300ul混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速移至冰浴3min,加入200ul LB培养基,37℃孵育45min。将培养物100ul涂在含有X‐gal,IPTG,Amp的1.5％琼脂平板上,倒置平板,37℃过夜培养。
四、阳性重组克隆的筛选和鉴定
1.阳性重组克隆的筛选:挑取生长状态好的白色菌斑,并提取质粒。
2.PCR鉴定:以重组质粒Bm‐myosin/pGEM‐T为模板,用Bm‐myosin的引物P1P2进行PCR反应,反应体系25ul,Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒1.5ul,10×PCR Buffer2.5ul,2.5mM dNTPmix4.0ul,P1P2各0.7ul,5U/ul TaqDNA聚合蛋白酶0.2ul,ddH2O15.4ul。循环参数为:94℃3min,94℃50s,51℃45s,72℃90s,共33个循环,最后一次循环72℃延伸反应时间为7min,4℃冷却终止反应。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.酶切鉴定:取经PCR鉴定正确的重组质粒,用BamHⅠ与XhoⅠ双酶切,用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
4、测序鉴定:将含有Bm‐myosin/pGEM‐T重组质粒的大肠杆菌穿刺斜面送上海生物工程公司测序。
五、Bm-MYOSIN二级结构预测
分别应用EXPASY服务器(http://www.expasy.ch/tools)上的SOPMA、GOR、nnPredict(University of California at SanFrancisco(UCSF))、HNN(Hierarchical NeuralNetwork method，Guermeur，1997)方法以及EMBOSS程序分析预测Bm‐myosin的二级结构。
六、Bm-MYOSIN亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测
采用Hopp&Woods亲水性参数、Emini表面可及性参数、Jameson‐Wolf抗原性参数、Zimmerman极性参数和柔韧性参数预测(http://www.expasy.org/cgi‐bin/protscale.pl)
七、Bm-MYOSIN T细胞表位预测
1.人源HLAⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为HLA‐A0201、HLA‐A1101，预测HLAⅠ类分子结合肽，保留输出的结果。
2.鼠源MHCⅠ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择AA长度为9‐mers，基因型为H2‐d(包括H2‐Kd、H2‐Ld和H2‐Dd，为H2‐d型小鼠表达的MHCⅠ类分子)，预测MHCⅠ类分子结合肽，保留输出的结果。
3.人源HLAⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择基因型为HLA‐DRB1*0101、HLA‐DRB1*0301、HLA‐DRB1*0401、HLA‐DRB1*0701、HLA‐DRB1*0801、HLA‐DRB1*0901、HLA‐DRB1*1101、HLA‐DRB1*1301、HLA‐DRB1*1501，预测HLAⅡ类分子结合肽，保留输出的结果。
4.鼠源MHCⅡ类分子结合表位的预测：将肌球蛋白的AA序列以FASTA格式输入Rankpep服务器，选择选择基因型为I‐Ad、I‐Ed，预测鼠源MHCⅡ类分子结合肽，保留输出的结果。
八、表位基因片段的选择
根据B细胞表位预测和T细胞表位预测结果，选择富含抗原表位的基因片段(562bp‐1269bp)设计引物，以质粒pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，并将该片段克隆至原核表达载体pET‐28a(+)中，构建pET‐BmM29。
应用Primer 5软件设计引物。
上游(P1)：5’‐GCGGATCCGCTAATGAATTGAATATGC‐3’
(其中下划线序列为BamHⅠ酶切位点)；
下游(P2)：5’‐CGGAATTCCTATGGTGAACGGAGTACGGT
(其中下划线序列为EcoRⅠ酶切位点)。
引物由上海生工生物技术有限公司合成，使用前用ddH2O溶解，浓度为10μmol/L。
九、目的基因片段原核表达载体构建
1、菌种活化和扩增
(1)取保存于‐80℃的菌种，用接种环划菌于1.5％琼脂平板上(含Amp)，37℃恒温倒置培养至单菌落出现。
(2)挑取单菌落，接种于4ml LB液体培养基中(含Amp)，37℃恒温，220rpm振荡培养12‐14h。
2、pET‐28a(+)质粒小量抽提
(1)取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清。
(2)加250μl悬浮液Buffer S1充分悬浮细菌沉淀至无小菌块。
(3)加250μl裂解液Buffer S2，温和并充分地上下翻转4‐6次，使菌体充分裂解。
(4)加350μl中和液Buffer S3，温和并充分地上下翻转6‐8次，12000rpm离心10min。
(5)吸取步骤4中的上清，转移到制备管(置于2ml离心管中)，12000rpm离心1min，弃滤液。
(6)向制备管中加500μl去盐液Buffer W1，12000rpm离心1min，弃滤液。
(7)向制备管中加700μl洗涤液Buffer W2，12000rpm离心1min，弃滤液；重复该步骤一次。
(8)将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min。
(9)将制备管移入新的1.5ml离心管，在制备管膜中央加60μl洗脱液Eluent，室温静置1min。12000rpm离心1min。离心管中的溶液即为所抽提的质粒。
3、表位基因片段PCR扩增
以pcDNA3.1(+)‐BmM55为模板，P1、P2分别为上、下游引物，反应体系见表1。
表1 PCR扩增反应体系
扩增反应参数为：
取5μl样品用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增目的基因。
胶回收
(1)切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用面纸吸尽凝胶表面液体，放到1.5ml离心管中(提前记录1.5ml离心管重量)，用镊子夹碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积(1mg＝1ml)。
(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE‐A，75℃加热约6‐8min，间断混合，直至凝胶块完全熔化。
(3)加入0.5个Buffer DE‐A体积的Buffer DE‐B，上下颠倒混合均匀。
(4)吸取步骤3中的溶液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12000rpm离心1min，弃滤液。
(5)向制备管中加500μl Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。
(6)向制备管中加700μl Buffer W2，12000rpm离心30s，弃滤液；再用700μl Buffer W2洗涤一次，12000rpm离心1min。
(7)将制备管置回2ml离心管中，12000rpm离心1min。
(8)将制备管置于1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μl Eluent，室温静置1min。12000rpm离心1min，管中的溶液即为回收的DNA溶液。
4、目的基因与载体连接与鉴定
①PCR产物及pET‐28a(+)载体质粒双酶切体系见表2。
表2 双酶切反应体系
目的基因与载体连接，具体反应体系见表3。
表3 目的基因与载体连接反应体系
混匀，室温反应30min以上，产物用于转化。
②E.coli DH5α感受态细胞的制备
(1)用接种环取保存于‐80℃DH5α菌液，划菌于不含抗生素的LB平板上，37℃倒置培养约14‐16h至单菌落出现。
(2)挑单菌落至5ml无抗性的LB液，37℃振荡培养约10‐12h。
(3)取1ml过夜培养的菌液至含100ml无抗LB液中，37℃振荡培养约2‐2.5h，到OD值达0.5，冰浴5‐10min。
(4)分装到2个50ml预冷无菌的离心管，4℃，1600rpm离心7min。
(5)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，4℃，1100rpm离心5min。
(6)用10ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，冰上放置30min后，4℃，1100rpm离心5min。
(7)用2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬细胞，分装后15％甘油冻存于‐80℃。
③转化及鉴定
(1)取100μl贮存于‐80℃钙化菌，冰浴化开；加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(2)热休克，42℃水浴30‐90s，勿动。
(3)快速转移到冰浴中，冷却1‐2min。
(4)加2.25ml LB液至试管，再加0.25ml混合物，倾斜放置，37℃，100rpm振荡培养45min。
(5)5000rpm离心1min。
(6)弃部分上清，混匀后倒在LB平板(含Amp)上，用涂布器涂均匀，室温静置，直至液体被吸收，37℃温箱倒置培养12‐16h。
(7)用白枪头挑单克隆至5ml LB液(含Amp)，37℃，220rpm振荡培养12‐16h，至OD值在0.6‐0.8之间。
(8)同时按上述步骤做阳性对照、阴性对照转化反应。
(9)提取质粒进行质粒电泳鉴定和PCR鉴定。
5、核酸序列测序鉴定:
选取PCR鉴定阳性菌液，于LB液体培养基中扩增后送上海英骏生物技术有限公司进行测序。
十、rBmM29重组蛋白表达和纯化
1、rBmM29重组蛋白的诱导
将重组质粒pET‐BmM29转化至E.coli BL21，菌落PCR鉴定为阳性后，进行诱导表达：
(1)将含有重组质粒的BL21接种于5ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；
(2)将上述菌液1:100比例转种入100ml LB培养基，200rpm震荡培养至OD600达0.5‐0.8；
(3)加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃诱导12h；
(4)4℃，6000rpm离心10min收集细菌；
(5)加入10ml蛋白纯化结合缓冲液，重悬菌体；
(6)200W超声10min(超声10s，间隔10s)，中间间隔10min，再超声10min(超声10s，间隔10s)，至菌液变澄清；
(7)4℃，12000rpm离心20min，收集上清。
2、重组蛋白的纯化
(1)取1ml镍琼脂糖填料置于4ml结合缓冲液中，轻轻混匀，静置数分钟后，将上层液体用移液器吸掉；重复该操作1次；
(2)将菌体裂解后的上清与镍琼脂糖填料混合后放在冰中，置摇床上孵育1h；
(3)将上述混合物转移至柱子中，让液体缓慢流出；
(4)用4ml洗涤缓冲液洗去杂蛋白，重复该操作1次；
(5)用5ml洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱的蛋白。
3、SDS‐PAGE分析
(1)将胶垫和玻璃板安装固定好；
(2)按表2‐4配制10％分离胶3.75ml，加入TEMED后立即混匀内容物倒入到固定好的玻璃板中，同时留出灌注浓缩胶所需空间，再在胶液面上小心注入异丙醇；
(3)待凝胶聚合完全后(约30min)倾出覆盖的异丙醇，用滤纸将残留的异丙醇吸尽；
(4)另取一只烧杯，按表2‐5配制5％浓缩胶2.5ml，加入TEMED后立即快速旋动混合物，并倒入玻璃板中；
(5)立即将梳子插入到浓缩胶内，注意不要有气泡，将凝胶室温静置30min；
(6)取出梳子，将凝胶板固定于电泳装置的上缓冲液室，放到下缓冲液室中，向上下缓冲液室加入1×电泳缓冲液；
表4 分离胶组份配制表
表5 浓缩胶组份配制表
(7)上样：将蛋白质分子量标准参照物和样品依次上样；
(8)电泳：分离胶电压100V，电泳90min，浓缩胶电压80V，电泳至溴酚蓝达分离胶底部；
(9)考马斯亮蓝染色：小心剥下分离胶凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，于摇床上轻轻摇动约1‐2h；
(10)将凝胶转移到盛有脱色液的平皿中，于摇床上轻轻摇动，每15min换一次液，至背景无色，拍照观察结果。
4、蛋白浓度测定
蛋白浓缩后，用紫外分光光度计测定在260nm和280nm波长的OD值，计算蛋白质含量(mg/ml)＝(1.45×A280‐0.74×A260)×稀释倍数。
十一、BmM29表位基因真核表达载体构建
纯化目的表位基因并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)的BamHⅠ和EcoRⅠ的克隆位点。目的基因和载体的摩尔比为5:1,反应体系25ul,16℃水浴连接过夜。取连接液转化感受态大肠杆菌DH5α,涂布于LB‐Amp(100mg/ml)平板上,37℃过夜培养。从LB‐Amp(100mg/ml)平板上随机挑取单个菌落,分别接种于LB‐Amp培养基中,37℃振荡过夜培养,提取重组质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切,后1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
十二、BmM29表位基因蛋白疫苗免疫应答试验
1.免疫佐剂CpG ODN的制备
新型佐剂中以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)最具代表性。CpG ODN合成的序列如下：CpG ODN 1826 5′‐TCCATGACGTTCCTGACGTT‐3′，并全链硫代磷酸骨架修饰来增强其核酸酶抗性，由上海英骏生物公司合成。用生理盐水溶解配制成1mg/ml。
2.实验动物分组
将48只BALB/c实验小鼠称量体重排序，按照随机数字表法分4组，每组12只，A：PBS对照组；B：空载体pcDNA3.1(+)/CpG组；C：重组蛋白/CpG组；D：重组蛋白/重组质粒/CpG组，免疫方案为0、2、4周各免疫一次。
3.接种部位预处理
DNA疫苗注射部位为小鼠后腿胫前肌，重组蛋白疫苗为皮下多点注射。将lml左旋盐酸布比卡因注射液稀释到14ml生理盐水中，得到0.5mg/ml稀释液。每次接种前24h，于接种部位注射左旋盐酸布比卡因50μl进行预处理。
4.免疫接种
A：PBS 100μl；B：pcDNA3.1(+)/CpG 100μg/30μg；C：rBmM29/CpG 50μg/30μg；D：前2次注射pcDNA3.1(+)‐BmM29/CpG 100μg/30μg，第三次注射rBmM29/CpG50μg/30μg。共免疫3次，每次间隔2周。
十三、免疫应答反应检测
1.血清采集：分别于初次免疫后4、6、8周用眼球摘除法收集小鼠血清，每组取4只小鼠。室温静置1h，置4℃过夜，待析出血清，4℃，4000rpm离心10min。分装血清，贮存于‐80℃。
2.免疫小鼠血清中IgG检测
(1)抗原包被：用抗原包被缓冲液将抗原稀释成5μg/mL，以100μl/孔包被酶标板，4℃过夜；
(2)弃液体，用PBST洗涤3次。使用100μl/孔封闭液封闭，室温静置1h；
(3)弃液体，血清用抗体稀释液按照1:100比例稀释后，100μl/孔，室温2h；
(4)用PBST洗涤3次；
(5)用样品稀释液1:2000稀释HRP偶联的IgG抗体后，100μl/孔，室温1h；
(6)使用PBST洗涤3次；
(7)加入100μl/孔底物液，作用15min后，加50μl 2mol/L H2SO4终止反应；
(8)在450nm处测定吸光值，保存数据。
3.小鼠脾细胞采集
(1)初次免疫后8周处死小鼠；
(2)取无菌10ml螺口管，加入3ml淋巴细胞分离液，37℃预热2h；
(3)将处死的小鼠置75％乙醇溶液中2‐3min进行消毒；
(4)将小鼠左腹侧朝上，用镊子将小鼠左腹部皮肤轻轻提起，用手术剪剪出约1cm长刀口，用手将腹部皮肤撕开，暴露腹膜，可见红色长条状脾脏，将其小心分离。
(5)将100目铜筛放入盛3ml Hank′s液的平皿中，将脾脏放在铜筛上，先将脾脏撕碎，再用玻璃棒轻轻研磨，直至铜筛上只剩下结缔组织，再用3ml Hank′s液冲洗铜筛；
(6)将含3ml淋巴细胞分离液的螺口管倾斜45°，用滴管将平皿中的细胞悬液沿管壁缓慢转移(淋巴细胞分离液:细胞悬液＝1:2)，不要冲破淋巴细胞分离液的界面；
(7)室温2000rpm离心20min，管中液体分为4层；
(8)取白色的第2层，转移至含10ml Hank′s液的50ml离心管中，室温1000rpm离心10min；
(9)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，室温1000rpm离心10min；
(10)弃上层液体，加入10ml Hank′s液，轻轻吹打混匀，用计数板计数；
(11)室温1000rpm离心10min，弃上层液体，加入适量完全培养基使得细胞的终浓度为2×106cells/ml。
4.细胞因子的诱生
24孔板加入2×106cells/ml细胞悬液475μl/孔，每孔各加100μl/ml ConA 25μl至终浓度为5μg/ml，5％CO2培养箱中37℃孵育48h。5000rpm离心10min收集培养液，取上清准备检测。
5.INF‐γ和IL‐4含量测定
(1)提前20min取出保存在4℃的ELISA试剂盒，平衡至室温；
(2)将浓缩洗涤液用ddH2O稀释20倍；
(3)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，加入标准样品(160pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、10pg/ml、0pg/ml)各50ul；
(4)从已平衡至室温的密封袋中取出酶标板，除空白孔外，分别加入样品稀释液40ul和待测样品10ul；
(5)除空白孔外，标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃孵育30min；
(6)弃去液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；
(7)每孔先加入显色剂A、B各50μl，37℃避光孵育15min；
(8)每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
(9)计算OD值：每个标准品和标本的OD值减去空白孔的OD值；
(10)绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，对应的OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线；
(11)通过样品的OD值可在标准曲线上查出该样品的浓度。
6.数据分析
应用SPSS19.0统计学软件分析样本数据，计量资料以均数±标准差表示，小鼠血清抗体的OD450值、小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN‐γ和IL‐4水平的组间比较比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK(Student‐Newman‐Keuls)法。P<0.05为差异有统计学意义。
表6 免疫小鼠血清抗体OD450值测定
注：*表示与两个对照组分别比较，差异有统计学意义，P＜0.05。
表7 不同免疫分组小鼠细胞因子INF‐γ和IL‐4水平(pg/ml)
注：*表示与两个对照组分别比较，差异有统计学意义，P＜0.05。
在成功地扩增出周期型马来丝虫肌球蛋白基因片段的基础上，综合其蛋白Bm-MYOSIN的二级结构预测和亲水性、表面可及性、极性及柔韧性参数等B细胞表位预测结果，以及T细胞表位预测研究结果表明，周期型马来丝虫肌球蛋白可能的B细胞表位区段为C端283-300、339-350、416-422区段且抗原性指数相对较高，C端部分的基因抗原表位更丰富。选择188-423位氨基酸进行研究。经1％琼脂糖电泳检测和测序，周期型马来丝虫肌球蛋白表位目的基因片段为708bp。基因测序与GeneBank上提供的序列blast比较的结果,同源性为98％，证明克隆片段正确。其表达蛋白为236个氨基酸，分子量为29kDa。
用IPTG诱导表达重组蛋白rBmM29，用亲和层析法将rBmM29进行纯化，并将rBmM29和pcDNA3.1(+)‐BmM29免疫接种小鼠。经ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体IgG水平和脾淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN‐γ、IL‐4水平。结果显示：两免疫组小鼠产生了高水平IgG抗体，均明显高于两对照组(P均＜0.05)。随着免疫次数的增加，免疫小鼠IgG抗体的OD450值呈上升趋势。免疫细胞因子检测结果显示：两免疫组小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFN‐γ和IL‐4的水平均明显高于两对照组，有显著统计学意义(P均<0.05)。以上实验结果证明周期型马来丝虫M29表位基因重组蛋白疫苗免疫接种可诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答反应，取得满意效果。周期型马来丝虫M29表位基因蛋白疫苗的制备获得成功。