一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法与流程

本发明涉及一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法。此发明可直接提供VP3蛋白作为GyV5诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV5血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。

背景技术：

鸡传染性贫血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CAV)一直被认为是圆环病毒科(Circoviridae)中环形病毒属(Gyrovirus)唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然目前尚无检测GyV5抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV5病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV5蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV5在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV5VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外重组技术克隆GyV5病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法，实现VP3蛋白的表达。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV5的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。

本发明所述的GyV5新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，以pGEX-6p-1质粒以及GyV5病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段(附图1，步骤1)，并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达(附图1，步骤3)。

上述方法包括以下步骤：

1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQ ID NO.2)；

2)利用下述引物，以GyV5-VP3基因为模板，PCR扩增出VP3基因；

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTTGGCTGACGAGTT3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAGTTCTTCTTGTA3’(SEQ ID NO.4)；

3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化。

本发明公开了PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物以及PCR扩增GyV5病毒VP3基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1线性化载体与GyV5病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。

本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速构建 GyV5病毒VP3基因的原核表达载体。本发明获得的GyV5病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV5诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV5流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

附图说明

图1一种GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备方法策略示意图

步骤1：以人工合成的GyV5病毒VP3基因为模板，利用引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段。

步骤2：利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆。

步骤3：阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。

图2 PCR扩增GyV5病毒VP3片段

泳道1，GyV5病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNA Marker。

图3 PCR扩增线性化载体pGEX-6p-1

泳道1，线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物；泳道M，DNA Marker。

图4 SDS-PAGE分析GyV5病毒VP3基因的表达

泳道1、2代表IPTG诱导的VP3超声裂解样品上清和沉淀；泳道3、4是纯化的VP3蛋白；泳道5、6是GST超声裂解样品上清和沉淀。

图5 Western blot鉴定抗AGV5VP3蛋白多克隆抗体

1,转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了GyV5新型环形病毒VP3蛋白制备的示例。

实施例

1)设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段引物：扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5’端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5’端带有额外CAT碱基。扩增GyV5病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV5病毒 VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列如下，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成。

pGEX-6p-1线性化表达载体引物：

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQ ID NO.2)；

GyV5-VP3基因引物：

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTTGGCTGACGAGTT3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAGTTCTTCTTGTA3’(SEQ ID NO.4)。

2)pGEX-6p-1线性化载体以及GyV5病毒VP3基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-1质粒以及合成的GyV5VP3基因(GenBank:KF294861.1)为模版，上述1)中引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1质粒或pcGyV5-VP3质粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：94℃变性5分钟,随后进行30个循环(94℃变性30秒,58℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M为DNA Marker，其中泳道1为GyV5病毒VP3片段PCR产物。如图3所示，其中泳道M为DNA Marker，泳道1为线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物。

3)GyV5病毒VP3片段快速克隆pGEX-6p-1载体：将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-1以及GyV5病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的GyV5病毒VP3片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1表达线性化载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水 至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。

4)GyV5病毒VP3蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含GyV5病毒VP3基因的阳性克隆(命名为pGEX-VP3)转化BL21细菌，经IPTG诱导(0.1mmol/ml)后收集细菌，进行超声(40赫兹)破碎。将超声破碎样品离心后分上清与沉淀进行SDS-PAGE(5％的浓缩胶，10％的分离胶)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST单抗为一抗，羊抗鼠HRP标记的IgG为二抗)鉴定表达。在图4中，VP3蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化。图4中泳道1、2代表IPTG诱导的VP3纯化前超声裂解样品上清和沉淀，泳道3、4是VP3蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果,泳道5、6是GST超声裂解样品上清和沉淀。为进一步测定纯化后蛋白的抗原性，评价其能否作为免疫原及诊断用抗原，将纯化的VP3蛋白免疫小鼠，并通过western blot分析证明了获得的抗GyV5病毒VP3蛋白的小鼠多抗能与在293T细胞中表达的VP3蛋白进行特异性反应(图5)。这一结果表明本发明表达的VP3蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV5血清学诊断中将具有良好的应用前景。