本发明属于动物病毒培养技术领域，更具体地，本发明涉及一种提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度的方法。
背景技术：
猪流行性腹泻(ped)是猪的一种急性、高度传染性的疾病，其病原是猪流行性腹泻病毒(pedv)，能引起猪的腹泻、呕吐、脱水、电解质平衡失调等症状，尤其是新生仔猪，有极高的死亡率。该病毒感染猪小肠上皮细胞导致粘膜萎缩引起吸收不良，近几年，该病在中国广泛蔓延，造成了严重的经济损失。
pedv的细胞培养较为困难，科研人员用尽各种方法，尝试了多种猪的原代及传代细胞但都以失败告终。1988年，hoffman等首次通过在细胞培养液中一次性加入适量胰酶，利用非洲绿猴肾细胞(vero)成功分离培养了pedv，pedv适应细胞难度很大，主要是因为病毒在细胞中增殖需要胰酶来促进，或者激活s蛋白，进入细胞形成核内体进行膜融合，而绝大多数分离得到的野毒株，都是依靠一次性添加一定量胰酶培养的，但一般培养成功的困难很大，并且增殖滴度很低，这也是目前对该病毒研究所面临的主要困难，在一定程度上制约pedv分子生物学的研究发展，严重阻碍ped疫苗的研究进展。
因此，针对猪流行性腹泻病毒这种难以稳定、高效培养的病毒，本领域迫切需要进一步研究培养方法，优化培养条件。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度的方法。
在本发明的第一方面，提供一种提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒的培养滴度的方法，所述方法包括：将胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒接种到非洲绿猴肾细胞(vero)中，接种2±1小时，较佳地2±0.5小时后，以含有定量胰酶的初始培养基培养非洲绿猴肾细胞，从而繁殖胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒；并且，在培养过程中每24±4小时补加胰酶1.5～5ug/ml。
在一个优选例中，以含有定量胰酶的初始培养基培养非洲绿猴肾细胞，初始培养基的胰酶浓度的量为0.1～30ug/ml；2～20ug/ml；更佳地为10～20ug/ml。
在另一优选例中，在培养过程中每24±2小时补加胰酶2～4ug/ml。
在另一优选例中，在非洲绿猴肾细胞培养(较佳地，利用dmem培养基培养)2-5天(较佳地如3-4天)，接种病毒。
在另一优选例中，在非洲绿猴肾细胞培养3-4天，接种病毒。
在另一优选例中，在接种病毒前，还包括：洗涤非洲绿猴肾细胞。
在另一优选例中，洗涤非洲绿猴肾细胞2-4次；较佳地以pbs洗涤。
在另一优选例中，非洲绿猴肾细胞的初始细胞传代浓度为5×105±5×104个/ml。
在另一优选例中，非洲绿猴肾细胞的初始细胞传代浓度为2×105±5×104个/ml。
在另一优选例中，所述的含有胰酶的初始培养基中，胰酶含量15±5ug/ml；较佳地15±3ug/ml；更佳地15±2ug/ml。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，经过多方面的条件分析，提供了一种提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度的方法。本发明的方法解决猪流行性腹泻病毒的增殖当中的问题，适用于提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度。本发明的方法与普通的培养条件相比较，胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度至少可以提高20倍。
本发明人在研究胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒的培养条件过程中，发现胰酶在37℃培养条件下，酶活会逐渐降低，尤其是1天后，其酶活可以下降一半以上。在该发现的基础上，本发明人进一步研究发现，胰酶酶活的降低对pedv在vero细胞的增殖产生了影响。因此，本发明人尝试了培养过程中补加胰酶促进培养pedv增殖的方法，从细胞接毒前培养的时间、胰酶补加量、接毒量等方面进行实验，验证了定时的补加定量的胰酶可以适当的提高pedv在vero细胞中的滴度。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供一种提高胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒的培养滴度的方法，所述方法包括：将胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒接种到非洲绿猴肾细胞中，以含有定量胰酶的初始培养基培养非洲绿猴肾细胞，从而繁殖胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒；并且，在细胞培养过程中补加胰酶。
在细胞培养过程中补加胰酶可以采用定时、定量化加入的方式。作为本发明的优选方式，在将胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒接种到非洲绿猴肾细胞2±1小时，较佳地2±0.5小时后，以含有胰酶的初始培养基培养，每24±4小时补加胰酶1.5～5ug/ml；较佳地2～4ug/ml。更佳地，所述的在培养过程中补加胰酶包括：在将胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒接种到非洲绿猴肾细胞2±0.3小时后，补加胰酶。作为本发明的优选方式，补加胰酶的量为2.5±0.5ug/ml，每24±2小时补加胰酶2.5±0.5ug/ml。在本发明优选培养方式下，给予了病毒适当量的活性良好的胰酶，为病毒在细胞内的扩繁创造了良好的条件。
本领域技术人员已知的可以用于培养非洲绿猴肾细胞的培养基可以被应用于本发明中，较佳地如dmem培养基。在制备含有胰酶的初始培养基时，可以在培养基中添加终浓度为15±5ug/ml的胰酶；较佳地终浓度为15±3ug/ml；更佳地终浓度为15±2ug/ml；进一步更佳地终浓度为15±1ug/ml。
通过观测培养过程中非洲绿猴肾细胞的整体细胞状态，本发明人发现，细胞培养3天左右接毒较为理想。因此，较佳地，在非洲绿猴肾细胞培养2-5天，较佳地3-4天后，接种病毒，从而保持非洲绿猴肾细胞的整体细胞状态良好。
作为本发明的优选方式，在接种病毒前，还包括：洗涤非洲绿猴肾细胞。可以根据实际操作条件来确定洗涤的次数，例如，洗涤2-4次。较佳地，以pbs洗涤。
作为本发明的优选方式，调节非洲绿猴肾细胞的初始细胞传代浓度为2×105±1×105个/ml；更佳地，调节非洲绿猴肾细胞的初始细胞传代浓度为2×105±5×104个/ml。该初始传代浓度可以使得后续非洲绿猴肾细胞维持较为理想的生长状态。
本发明中，病毒滴度(tcid50)的测定可以根据本领域常规方法进行。比如可以按照韩先杰、王宏伟、王金宝，《猪繁殖与呼吸综合征病毒tcid50的测定》，莱阳农科院学报22(2)：132～134，2005中所报导的方法；或者，可以按照本发明实施例中阐述的方法。
在本发明的具体实施例中，从细胞接毒前培养的时间、胰酶补加量、接毒量等方面进行比较，试验毒株为pedv-dr13skf650375fcs(胰酶依赖型)，优选出如下最佳培养方案，包括：胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)优选出最佳培养方案：初始细胞传代浓度为2*105个/ml，t25细胞瓶培养(10％fbsdmem)3天，冲洗，加入1ml(30ul病毒液+15ug/mltrypsin+dmem)孵育病毒2h，弃病毒接种液，补加5mldmem+75ugtrypsin培养，每隔24h补加12.5ugtrypsin。
本发明的方法有效促进了胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度的提高，与普通的培养条件相比较，胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养滴度至少可以提高20倍。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
i.实验材料与方法
1、实验材料
细胞：vero细胞，购自atcc公司。
毒株：pedv-dr13skf650375fcs(胰酶依赖型)如下构建：将p-rpedvvector中的s基因替换成流行毒株(kf650375)的s基因，并将s基因的gta2671-2673nt突变成cgc2671-2673nt，人工引入弗林蛋白位点，得到p-pedv-dr13skf650375fcsvector,经pedv反向遗传操总体系，得到重组病毒pedv-dr13skf650375fcs(胰酶依赖型)，详细方法参考该文献，lic,liz,zouy,etal.manipulationoftheporcineepidemicdiarrheavirusgenomeusingtargetedrnarecombination.[j].plosone,2013,8(8)::e69997.。
试剂包括：dmem，fbs(fetalbovineserum)，pbs，0.25％trypsin和0.25％trypsin-edta，均购于gibco公司。
2、胰酶随时间延长活性降低的预试验
(1)每隔24h，取一支装有1ml0.25％trypsin的ep管放入37℃培养箱，并作标记，编号如表1；连续5天，在倒数第2天准备5瓶(t25培养瓶)的vero细胞；
(2)第5天，超净台紫外照射30min以上，同时从4℃冰箱取出分装好的pbs、放入水浴锅37℃，水浴5-10min；
(3)光镜下观察之前准备的5瓶vero细胞(完全铺满)，之后放入超净工作台，吸取pbs2ml，轻轻晃细胞瓶，细胞瓶底部都接触到pbs后，吸掉pbs，重复三次；
(4)将37℃培养箱的5支0.25％trypsin的ep管取出，分别从每管中取1ml的0.25％trypsin加入细胞培养瓶中，摇匀，放置于37℃的co2培养箱里孵育计时，直到细胞圆缩，并随拍打脱落，计时结束。
表1、胰酶37℃培养时间
3、vero细胞传代
(1)超净台紫外照射30min以上，同时从4℃冰箱取出分装好的pbs、0.25％trypsin-edta及10％fbs的dmem，放入水浴锅37℃水浴5-10min；
(2)光镜下观察细胞完全铺满时(一般是自上次传代2-3日)，就可以进行细胞传代。
(3)吸取pbs2ml，轻轻晃细胞瓶，使细胞瓶底部都接触到pbs后，吸掉pbs，重复3次；
(4)加1ml的0.25％trypsin-edta，摇匀，放置于37℃的co2培养箱里孵育1-2min(时间随季节变化，一般春夏天气温暖时只需要3分钟以内，而秋冬天气寒冷时则要10分钟甚至更久)；直到细胞圆缩，并随拍打脱落；
(5)加入2ml10％fbs的dmem终止消化，吹打均匀，用计数仪细胞计数，配制2×105个/毫升的细胞液，向t25瓶(分两批，每批9瓶)中加入5ml培养液，混匀，放回培养箱。各管胰酶的具体培养时间如表1所示。
4、pedv病毒的增殖
(1)用0.25％trypsin配制15ug/ml胰酶浓度的dmem；
(2)取出上步培养的vero细胞用pbs缓慢轻柔冲洗细胞单层3次，弃pbs，将pedv-dr13skf650375fcs(胰酶依赖型)与1ml的含有胰酶的dmem均匀混合(胰酶终浓度15ug/ml)，接种到vero细胞单层中，摇匀，标记样品号，如表1所示。
(3)加了病毒的细胞放回37℃温箱相应位置，孵育2h，然后弃掉接种液，再向其中加入5ml温的15ug/ml胰酶浓度的dmem，继续放温箱培养；
(4)每24h观察每瓶细胞病变情况，并在超净工作台中补加入对应量的胰酶，观察细胞状态及细胞病变情况，至大多数细胞样品80％以上脱落时，将细胞瓶移至-80℃低温冰箱暂时保存。
5、pedv病毒的收毒
(1)将上述-80℃低温冰箱暂存的病毒细胞培养液在-80℃与37℃间反复冻融3次；
(2)最后一次融化时转移至10ml离心管，4℃、3000rpm离心10min；
(3)取出上清，分装到2ml冻存管中，每管1.5ml；
(4)做好标记，存-80℃。
6、pedv病毒的滴度测定
(1)向平底96孔板中接种2×105个/mlvero细胞，每孔100μl，标记后放培养箱培养48h；
(2)待细胞长成单层后，用pbs(每孔100ul)清洗两次，之后加入dmem(每孔100ul)，放入培养箱培养24h；
(3)细胞长成单层后，将pedv在圆底96孔板中10倍比稀释，每个代次的每个稀释度做6个重复；
(4)吸弃细胞培养上清液，将稀释好的pedv接种到细胞单层上，晃匀，标记好样品号和日期，放37℃培养；
(5)逐日观察，至不出现新的病变孔为止；
(6)tcid50的计算：
按公式logtcid50＝xa-d(sp-0.5)计算；
xa＝最后一排全出现病变的稀释度的log值；
d＝稀释倍数的log值(比如10倍比稀释，log10＝1)；
sp＝最后一排全有cpe和第一排全没有cpe之间的阳性孔个数/每个稀释度所做的平行孔数；
试验共计18个样品，各个样品的细胞接毒前培养的时间、胰酶补加量、接毒量的详细信息如表2所示。
表2
实施例1、胰酶随时间延长活性降低的预试验
本实施例中，验证胰酶在37℃下是否会随时间延长活性降低。胰酶的酶活性用胰酶消化细胞的时间来间接证明。方法步骤如前述“2、胰酶随时间延长活性降低的预试验”。
37℃培养不同时间的胰酶消化细胞的时间如表3。
表3
由表3可知，随着胰酶在37℃条件下培养的时间越长，细胞需要消化下来的时间越长。培养1天后，胰酶消化细胞所需要的时间就延长了4倍，也间接提示该胰酶的酶活下降约4倍。该结果也提示，由于pedv病毒(胰酶依赖型)在vero细胞中增殖需要胰酶来促进，这种胰酶酶活的下降对pedv在vero细胞中的增殖会产生巨大影响。
实施例2、样品接毒前细胞的培养时间
如前述“实验材料与方法4-6”中描述的方法步骤，进行细胞培养，并考察样品接毒前细胞的培养时间。
各个样品状态具体情况如表4所示。
由表4可知，1-9号样品的整体细胞状态，滴度均好于10-18号样品，因此，细胞培养3天左右接毒较为理想，注意初始细胞传代浓度为2×105个/ml，细胞培养需要3天或多于3天，否则vero细胞在接毒后，在15ug/ml的胰酶浓度下状态较差。
表4
表中，“滴度测定”测的是收毒以后的滴度，即补加胰酶2天后的滴度。
实施例3、样品未补加胰酶与补加胰酶区别
如前述“实验材料与方法4-6”中描述的方法步骤，进行细胞培养，并考察样品未补加胰酶与补加胰酶区别。
各个样品的滴度测定结果如表5。
表5
由表5可知，补加胰酶样品(每隔24h补加一定量的胰酶)滴度比10号样品(未补加胰酶)相比，滴度显著提高，说明定时向培养基补加胰酶可以促进病毒的增殖。
实施例4、样品补加胰酶量
如前述“6、pedv病毒的滴度测定”中描述的方法步骤，进行细胞培养，并考察样品补加胰酶量的较佳范围。
补加不同量胰酶的样品的平均滴度如表6。
表6
由表6可知，每隔24h补加胰酶的量控制在2.5ug/ml时，病毒的滴度与未补加相差近20倍，并且补加大剂量的胰酶，滴度并没有直线增加，分析很有可能与胰酶浓度过高，而造成细胞状态不好，甚至提前死亡，使得病毒无法增殖有关。
根据上述实施例，本发明人认为：胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)优选出最佳培养方案(t25细胞瓶培养细胞)：初始细胞传代浓度为2×105个/ml，96孔板中细胞培养(10％fbsdmem)3天，冲洗，加入1ml(30ul病毒液+含胰酶的dmem)孵育病毒2h，弃病毒接种液，补加5mldmem，培养体系中胰酶终浓度15ug/ml，培养；每隔24h补加胰酶(浓度2.5ug/ml)。与普通的培养条件相比较，用上述方法进行胰酶依赖性猪流行性腹泻病毒(pedv)培养，病毒滴度至少可以提高20倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。