含增加2-卤酸脱卤酶活性的基因修饰的重组微生物及其用于降低样品氟化甲烷浓度的方法与流程

相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月17日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2016-0134549的优先权，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。通过引用并入的电子提交的材料通过引用整体并入本申请的是与本申请一起提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其标识如下：创建的字节的文件名为“728866_st25.txt”的ascii(文本)文件。
背景技术：
：1.发明领域本申请涉及包含增加2-卤酸脱卤酶活性的基因修饰的重组微生物，用于在样品中降低氟化甲烷浓度的组合物，所述组合物包含重组微生物，以及在样品中降低氟化甲烷浓度的方法。2.相关技术说明加快全球变暖的温室气体排放是严重的环境问题，减少和预防温室气体排放的规定已经越来越严格。在温室气体中，诸如全氟化碳(pfc)、氢氟碳化物(hfc)或六氟化硫(sf6)的氟化气体(f-气体)显示出较低的绝对排放，但是其具有较长的半衰期和非常高的引起全球变暖的潜能，结果对环境导致严重的不良影响。作为f-气体排放主要原因的半导体工业和电子工业排放的f-气体量已经超出了温室气体的指定排放量并且在持续增加。因此，将温室气体分解所需的费用和温室气体排放限额每年都在增加。在f-气体分解中通常使用热解或催化热氧化法。然而，该方法具有分解速率有限、二次污染物排放、成本较高等缺点。为解决这一问题，已提出采用微生物生物催化剂对f-气体进行生物分解。因此，仍需要以更经济和更加环境友好的方式处理f-气体的新型组合物和方法。发明概述本发明的一个方面提供了一种重组微生物，所述重组微生物包含与不具有所述基因修饰的相同微生物相比增加2-卤酸脱卤酶(had)活性的基因修饰，以及用于制备所述重组微生物的方法。本发明的另一个方面提供了一种用于降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)浓度的组合物，所述组合物包含重组微生物，所述重组微生物包含增加had活性的基因修饰。本发明的又一个方面提供了一种降低样品中chnf4-n浓度的方法，所述方法包括将重组微生物与含有chnf4-n(其中n为0至3的整数)的样品接触以降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)的浓度，其中所述重组微生物包含增加had活性的基因修饰。附图说明从以下结合附图对实施方式的描述中，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更易于理解，其中：图1显示了pet-bchad载体的载体图谱；以及图2显示了pet-bghad载体的载体图谱。发明详述如在本申请中所使用，术语“活性增加”或“增加的活性”或“增加活性”等可以指细胞、蛋白或酶活性可检测的增加。“活性增加”或“增加的活性”还可以指经修饰(例如经基因工程改造)的细胞、蛋白或酶的活性水平高于相同类型的比较细胞、蛋白或酶，如不具有给定基因修饰的细胞、蛋白或酶(例如原始或“野生型”的细胞、蛋白或酶)。短语“细胞活性”可以指细胞的特定蛋白或酶的活性。例如，经修饰或工程改造的细胞、蛋白或酶的活性与相同类型的未经工程改造的细胞、蛋白或酶(即野生型细胞、蛋白或酶)的活性相比可能增加约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高或者约100％或更高。可以采用本领域公知的任何方法对具有增加的蛋白或酶活性的细胞进行鉴定。可以通过增加其表达或特定活性实现增加酶或多肽的活性。可以通过将编码酶或多肽的多核苷酸引入细胞，通过另外增加编码酶或多肽的基因的拷贝数，通过修饰编码酶或多肽的多核苷酸的调控区实现表达增加。在其中引入基因的微生物可以是内源性包含该基因(例如外源性基因与微生物是同源的)的微生物或者内源性不包含该基因(例如外源性基因与微生物是异源的)的微生物。该基因可以与能够使其表达的调控序列可操作地连接，例如例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化位点或其组合。拷贝数增加的多核苷酸可以是内源性的或外源性的。内源性基因指在引入增加酶或多肽活性的基因修饰以前已经存在于微生物遗传物质中的基因。外源性基因指从外部引入细胞中的基因，并且其相对于引入该基因的宿主细胞可以是同源性或异源性的。术语“异源性”指“外源性的或非天然的”。因此，即使在微生物中已存在相同或相似的基因，也可以引入“外源性”基因。可以通过引入外源性基因或扩增内源性基因实现“拷贝数增加”。任选地，可以通过对细胞进行基因工程改造引入在未经工程改造的细胞中不存在的基因实现拷贝数增加。可以由媒介如载体介导基因的引入。引入可以通过瞬时引入进行，在其中基因未整合至基因组(例如在游离基因如质粒中)，或者通过将基因整合至基因组进行。例如可以通过将载体引入细胞，该载体包含编码目标多肽的多核苷酸，然后在细胞中复制载体或通过将多核苷酸整合至基因组进行引入。基因的引入可以通过公知的方法进行，如转化、转染或电穿孔。基因可以通过媒介或通过自身引入。如在本申请中使用的，术语“媒介”指能够递送与其连接的其他核酸的核酸分子。作为介导特定基因引入的核酸序列，将在本申请中所使用的媒介解释为可互换使用的载体、核酸构建体和表达盒。载体可以包括例如质粒载体、来源于病毒的载体等。质粒可以是可与另一dna连接的环状双链dna分子。载体可以包括例如质粒表达载体、病毒表达载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)或其组合。可以使用本领域公知的分子生物学方法进行本公开中使用的基因修饰。术语“亲本细胞”指原始细胞或与所产生的经基因工程改造细胞的原始细胞是相同类型的细胞。对于特定的基因修饰而言，“亲本细胞”可以是缺乏特定的基因修饰，但是所有其他方面是相同的细胞(无论此前是否经过工程改造)。因此，亲本细胞可以是作为用于生产经基因工程改造的具有增加的给定蛋白(例如与2-卤酸脱卤酶具有约95％或更高的氨基酸序列同一性的蛋白)活性的微生物的起始原料的细胞。同样的比较也适用于其他基因修饰。在一些实施方式中，亲本细胞可以是野生型细胞。如在本申请中所使用的，术语“基因”指表达特定蛋白的核苷酸片段，并且该片段可以或可以不与调控序列(例如5’-非编码序列和/或3’-非编码序列)可操作地连接。如在本申请中所使用的，术语多核苷酸或多肽的“序列同一性”指在进行序列比对后获得的序列的碱基或氨基酸残基之间的同一性程度以使得在某些可比较区域中为最佳匹配。序列同一性是通过对两条序列进行最佳比对对在某些可以比较区域中的两条序列进行比较获得的值，其中在某些可比较区域中的序列的部分与参照序列相比可以增加或缺失。可以通过例如在整个可比较区域中对两条最佳比对序列进行比较，确定相同氨基酸或核酸出现的位置数以获得匹配位置数，使用可比较区域中的匹配位置数除以位置总数(例如范围的尺寸)并将除得的结果乘以100以获得序列同一性百分率计算序列同一性百分率。可以使用公知的序列比较程序例如blastn(ncbi)、blastp(ncbi)、clc主要工作台(clcbio)、megaligntm(dnastarinc)或emboss针确定序列同一性百分率。例如，可以使用应用缺省设置(空位开放罚分10，空位延长罚分0.5；末端空位罚分＝假，末端空位开放-10，使用blosum62矩阵进行氨基酸序列比较)的emboss中的needleman-wunsch全局比对算法。可以使用不同水平的序列同一性以鉴别具有相同或相似的功能或活性的不同类型的多肽或多核苷酸。例如，序列同一性可以包括约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高、约99％或更高或者100％的序列同一性。对于编码给定蛋白的多核苷酸序列而言，可以根据遗传密码的简并性使用其他核苷酸序列取代。如在本申请中所使用的，术语“基因修饰”指在细胞遗传物质的构成或结构中的人工改变。在本发明中，除非另有说明，％表示w/w％。本公开的一个方面提供了一种包含增加2-卤酸脱卤酶(had)活性的基因修饰的重组微生物。2-卤酸脱卤酶是一种催化化学反应2-卤酸+h2o2-羟基酸+卤化物的酶。因此，该酶的两个底物是2-卤酸和h2o，以及其两个产物是2-羟基酸和卤化物。该酶属于水解酶家族，其作用于碳-卤化合物的卤化物键。然而，就降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)的浓度而言，不应将重组微生物解释为限定在该特定机制。had可以属于ec3.8.1.2。had可以是外源性的或内源性的。had可以选自来自芽孢杆菌(bacillus)属、假单胞菌(pseudomonas)属、固氮菌(azotobacter)属、农杆菌(agrobacterium)属和埃希氏杆菌(escherichia)属的had。had可以来自选自下组的菌株：蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)和巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)。had可以是与seqidno：1、3、5、7、9和11所示的氨基酸序列具有约95％或更高的序列同一性的多肽。就上述微生物而言，基因修饰可以增加编码had的基因的表达。基因修饰可以增加had基因的拷贝数。基因修饰可以分别增加编码与seqidno：1、3、5、7、9和11所示的氨基酸序列具有95％或更高的序列同一性的多肽的基因中的一个或多个基因的拷贝数。该基因可以分别与seqidno：2、4、6、8、10和12所示的核苷酸序列具有95％或更高的序列同一性。基因修饰可以是例如通过媒介如载体引入编码had的外源性基因。编码had的基因可以存在于染色体的内部或外部。所引入的编码had的基因可以是多个基因(例如相同基因的重复和/或编码多个基因变体的基因的混合物)，例如2个或更多、5个或更多、10个或更多、50个或更多、100个或更多或者1000个或更多。微生物可以属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、黄色杆菌属、假单胞菌属、固氮菌属或农杆菌属。微生物可以是例如e.coli或x.autotrophicus物种。微生物还可以包含选自由编码argu的基因和编码prol的基因组成的组的一个或多个基因。编码argu的基因可以编码识别精氨酸密码子aga和agg的trna的基因。编码prol的基因可以编码识别脯氨酸密码子ccc的基因。微生物可以是bl21-codonplus(de3)-rp(或具有类似密码子偏好降低特性的其他菌株)，其进一步包含编码argu的基因和编码prol的基因这两者。微生物还可以包含或经修饰以包含选自下组的一个或多个基因：编码argu的基因、编码iley的基因和编码ilew的基因。编码iley的基因可以编码识别异亮氨酸密码子aua的trna。编码ilew的基因可以编码识别亮氨酸密码子cua的trna。微生物可以是bl21-codonplus-ril或bl21-codonplus(de3)-ril，其进一步包含编码argu的基因、编码iley的基因和编码ilew的基因中的全部。重组微生物可以降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)(在本申请中称为“氟化甲烷”)的浓度。可以通过利用had酶蛋白对氟化甲烷上的c-f或c-h键的作用或者通过在微生物的细胞内蓄积氟化甲烷将羟基引入氟化甲烷中的碳进行降低。而且，降低可以包括将chnf4-n的c-f键裂解，将chnf4-n转化成其他物质或者使chnf4-n在细胞内蓄积。样品可以处于液态或气态。样品可以是工业废水或废气。样品可以是包含氟化甲烷的任何样品。氟化甲烷可以包括cf4、chf3、ch2f2、ch3f或其混合物。降低样品中的chnf4-n包括将chnf4-n降低任何程度，包括完全除去chnf4-n。样品可以是气体或液体。组合物还可以包含增加氟化甲烷在介质或培养基中的溶解度的物质，如实施例。本发明的另一个方面提供了一种用于降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)(下文中称为“氟化甲烷”)的浓度的组合物，所述组合物包含含有增加2-卤酸脱卤酶(had)活性的基因修饰的重组微生物。本发明的又一个方面提供了一种降低样品中chnf4-n浓度的方法，该方法包括将重组微生物与含chnf4-n(其中n为0至3的整数)的样品接触以降低样品中chnf4-n(其中n为0至3的整数)的浓度，其中重组微生物包含增加2-卤酸脱卤酶(had)活性的基因修饰。重组微生物、样品和氟化甲烷与上文所述的是相同的。组合物或方法可以通过将组合物与样品接触降低样品中氟化甲烷的浓度。接触可以在液相或固相中进行。可以例如通过在培养过程中将所培养的微生物的培养物与样品接触进行接触。任选地，可以在可以使微生物增殖的条件下进行培养。在一些实施方式中，可以在密封容器(例如防止氟化气体逸出的容器)中进行接触。短语“密封容器”表示气密状态。接触可以包括培养或孵育重组微生物的同时将其与含有chnf4-n(其中n为0至3的整数)的样品接触。接触可以包括在可以使重组微生物可以存活或增殖的条件下或者使重组微生物可以处于静止状态的条件下培养重组微生物。当微生物的生长阶段处于指数期或静止期时，可以进行接触。可以在有氧或无氧条件下进行培养。样品可以处于液态或气体。样品可以是工业废水或废气。样品可以包括将样品与微生物培养物被动接触和将样品与微生物培养物主动接触。样品可以例如喷入微生物培养物中。也就是说，可以将样品喷入培养基或培养物中。喷射可以是将样品从培养基或培养物的底部向顶部喷射。可以通过注入样品的液滴或气泡进行喷射。可以以间歇或连续的方式进行重组微生物与样品的接触。接触可以包括例如将包含增加had活性的基因修饰的新鲜重组微生物与在此前的接触步骤中获得的样品接触。换言之，该方法可以包括将样品与重组微生物重复接触，使得样品与新鲜微生物接触2次或更多次，例如2次、3次、5次或10次或者更多次。或者或另外地，可以通过连续输入新鲜微生物和任选地连续除去使用过的微生物将新鲜微生物与样品接触。术语“新鲜”微生物指未与样品接触过的重组微生物。“使用过的”微生物指已经与样品接触过的重组微生物。接触可以是连续的或重复的直至样品中氟化甲烷的浓度达到所需的降低的浓度。本发明的又一个方面提供了一种生产微生物的方法，所述方法包括将增加2-卤酸脱卤酶(had)活性的基因修饰引入微生物。该方法可以是生产微生物的方法，包括将编码had的基因引入微生物。可以通过将包含外源性基因的媒介引入微生物实现引入编码had的基因。对于方法而言，基因修饰可以包括扩增基因、操纵基因的调控序列或操纵基因序列本身。操纵可以是核苷酸的插入、取代、转化或加入。方法还可以包括在微生物中增加选自由编码argu的基因和编码prol的基因组成的组的一个或多个基因的拷贝数。方法还可以包括在微生物中增加选自由编码argu的基因、编码iley的基因和编码ilew的基因组成的组的一个或多个基因的拷贝数。可以将根据一个方面的重组微生物用于除去样品中的chnf4-n。可以将根据另一个方面组合物用于除去样品中的chnf4-n。可以将根据又一个方面的降低样品中chnf4-n浓度的方法用于有效降低样品中chnf4-n的浓度。现在将详细地提及实施方式，其示例在附图中示出，其中相同的附图标记始终表示相同的元件。在这方面，本实施方式可以具有不同的形式，并且不应被解释为限于本申请所示的描述。因此，下面仅通过参考附图对实施方式进行描述来解释这些方面。如在本申请中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任意和所有组合。所提供的这些实施例仅用于说明目的，本发明不受这些实施例的限制。实施例1：通过芽孢杆菌菌株分解cf4在30℃和230rpm下振荡的条件下在lb培养基中培养芽孢杆菌(kctc3624)和巨大芽孢杆菌(dsm32)菌株直至细胞密度达到od600＝3.0。将10ml各细胞培养物加入60ml血清瓶中，并将瓶密封。lb培养基每1l蒸馏水含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gnacl。接下来，使用注射器将气相cf4通过血清瓶盖上的橡胶塞注入至其顶部空间浓度为1000ppm。随后，将血清瓶在30℃和230rpm条件下振荡孵育5天。每项实验重复进行三次。孵育后，使用1.0ml顶空注射器收集血清瓶中0.5ml不含培养基的顶空气体并注入gc(agilent7890,paloalto,ca,usa)。通过cp-porabondq柱(长度25m，0.32mmi.d.，薄膜厚度5um，agilent)分离注入的顶空样品并且通过质谱(agilent5973,paloalto,ca,usa)分析cf4浓度的变化。使用氦气作为载气，并以1.5ml/min的流速加入柱。气相色谱(gc)条件如下：入口温度为250℃，初始温度在40℃保持2分钟，然后以20℃/分钟的速率升温到290℃。质谱条件如下：电离能为70ev，界面温度为280℃，离子源温度为230℃和四极温度为150℃。表1显示了当在上述条件下培养b.cereus和b.megaterium菌株时样品中残留cf4的百分率。如表1中所示，与仅含有lb培养基的对照组相比，b.cereus和b.megaterium菌株培养物显示出顶空cf4浓度分别降低约6.63％和约9.33％。[表1]菌株残留cf4(％)对照(培养基)100.00b.cereus93.37b.megaterium90.67实施例2：制备引入来自蜡状芽孢杆菌的had基因的重组e.coli以及使用其分解cf41.扩增来自蜡状芽孢杆菌的had基因(bchad)以及将该基因引入e.coli在30℃和230rpm下振荡过夜在lb培养基中培养b.cereus(kctc3624)，然后使用总dna提取试剂盒(invitrogenbiotechnology)分离基因组dna。使用该基因组dna作为模板和具有表2中给出的核苷酸序列的引物对进行pcr以分别扩增和获得bc2730、bc3334和bc5408基因。因此，使用infusioncloning试剂盒(clontechlaboratories,inc.)将扩增的bchad基因分别与使用限制性内切酶ncoi和hindiii消化的petduet-1(novagen，目录号71146-3)连接以制备3个pet-bchad载体。图1显示了pet-bchad载体的载体图谱。bc2730、bc3334和bc5408分别具有seqidno：1、3和5所示的氨基酸序列。其基因分别具有seqidno：2、4和6所示的核苷酸序列。接下来，通过热休克法将制备得到的3个pet-bchad载体pet-bc2730、pet-bc3334和pet-bc5408中的每一个引入e.colibl21，然后在含有100μg/ml氨苄西林的lb平板上培养。选择显示出具有氨苄西林抗性的菌株。最后，将由此选出的三个菌株分别命名为重组e.colibl21/pet-bc2730、bl21/pet-bc3334和bl21/pet-bc5408。[表2]2.通过引入bchad基因的e.coli分解全氟甲烷在这部分中，考察了在第(1)部分中制备的3种重组e.colibl21/pet-bchad菌株是否能够影响从样品中除去cf4。具体而言，在30℃和230rpm下振荡的条件下在tb培养基中培养bl21/pet-bc2730、bl21/pet-bc3334和bl21/pet-bc5408中的每一个。在od600约0.5时，向其中加入0.2mm的iptg，随后在20℃和230rpm下振荡培养过夜。收集这些细胞并将其混悬在lb培养基中以达到od600为3.0的细胞密度。将10ml各细胞悬液加入60ml血清瓶中，然后将瓶密封。lb培养基具有与实施例1中相同的组成。接下来，使用注射器将气相cf4通过血清瓶盖上的橡胶塞注入至其顶部空间浓度为1000ppm。随后，将血清瓶在30℃和230rpm条件下振荡孵育4天。每项实验重复进行三次。孵育后，在与实施例1中相同的条件下分析血清瓶中cf4的顶空浓度。表3显示了当在上述条件下培养重组e.colibl21/pet-bchad菌株时样品中残留cf4的百分率。如表3中所示，与引入空载体的对照组相比，引入bchad(bc2730、bc3334或bc5408)的重组e.coli菌株显示出顶空cf4浓度降低约1.69％、约5.67％和约5.44％。[表3]重组菌株残留cf4(％)对照(空载体)100.00bc273098.31bc333494.33bc540894.56实施例3：制备引入来自巨大芽孢杆菌的had基因的重组e.coli以及使用其分解cf41.扩增来自巨大芽孢杆菌的had基因(bghad)以及将该基因引入e.coli在30℃和230rpm下振荡过夜在lb培养基中培养b.megaterium(dsm32)，然后使用总dna提取试剂盒(invitrogenbiotechnology)分离基因组dna。使用该基因组dna作为模板和具有表4中给出的核苷酸序列的引物对进行pcr以分别扩增和获得bg04_670、bg04_3297和bg04_3843基因。bg04_670、bg04_3297和bg04_3843分别具有seqidno：7、9和11所示的氨基酸序列。其基因分别具有seqidno：8、10和12所示的核苷酸序列。因此，使用infusioncloning试剂盒(clontechlaboratories,inc.)将扩增的bghad基因分别与使用限制性内切酶ncoi和xhoi消化的pet28a(novagen，目录号69864-3)连接以制备3个pet-bghad载体。图2显示了pet-bghad载体的载体图谱。接下来，通过热休克法将制备得到的3个pet-bghad载体pet-bg04_670、pet-bg04_3297、pet-bg04_3843中的每一个引入e.colibl21，然后在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上培养。选择显示出具有卡那霉素抗性的菌株。最后，将由此选出的三个菌株分别命名为重组e.colibl21/pet-bg04_670、bl21/pet-bg04_3297和bl21/pet-bg04_3843。[表4]通过引入bghad基因的e.coli分解全氟甲烷在这部分中，考察了在第(1)部分中制备的3种重组e.colibl21/pet-bghad菌株是否能够影响从样品中除去cf4。具体而言，在30℃和230rpm下振荡的条件下在tb培养基中培养bl21/pet-bg04_670、bl21/pet-bg04_3297和bl21/pet-bg04_5408菌株中的每一个。在od600约0.5时，向其中加入0.2mm的iptg，随后在20℃和230rpm下振荡培养过夜。收集这些细胞并将其混悬在lb培养基中以达到od600为3.0的细胞密度。将10ml各细胞悬液加入60ml血清瓶中，然后将瓶密封。lb培养基具有与实施例1中相同的组成。接下来，使用注射器将气相cf4通过血清瓶盖上的橡胶塞注入至其顶部空间浓度为1000ppm。随后，将血清瓶在30℃和230rpm条件下振荡孵育4天。每项实验重复进行三次。孵育后，在与实施例1中相同的条件下分析血清瓶中cf4的顶空浓度。表5显示了当在上述条件下培养重组e.colibl21/pet-bghad菌株时样品中残留cf4的百分率。如表5中所示，与引入空载体的对照组相比，引入bghad(bg04_670、bg04_3297或bg04_3843)的重组e.coli菌株显示出顶空cf4浓度降低约6.01％、约8.55％和约8.95％。[表5]重组菌株残留cf4(％)对照(空载体)100.00bg04_67093.99bg04_329791.45bg04_384391.05在本发明描述的上下文中(特别是在随后的权利要求的上下文中)，应将术语“一(a)”和“一(an)”和“所述(the)”和“至少一个(atleastone)”以及相似指示词的使用理解为包括单数和复数，除非在本申请中另有说明或者与上下文明显矛盾。应将术语“至少一个”后接一个或多个项目的列表(例如，“a和b的至少一个”)的使用解释为指从所列项目(a或b)中选出的一个项目或者所列项目(a和b)的两个或多个的任意组合，除非在本申请中另有说明或者与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”都应理解为开放式术语(即，意思是“包括，但不限于”)，除非另有注明。本申请中对范围的描述仅仅旨在作为一种对每个落在该范围内的单独数值的简略写法，且每个单独的数值都被包括在说明书中，就像单独地写在本申请中一样。所有在本申请中描述的方法都可以按照任何适当的顺序进行，除非在本申请中另有指明或者除非与上下文明显矛盾。在本申请中任何和所有的实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用，都仅旨在更好地阐明本发明，而不是在本发明的范围上加以限制，除非另有主张。不应将在说明书中的语言理解为表明任何未主张的要素是实施本发明所必需的。本申请中描述了本发明的优选实施方式，包括发明人所知道的实施本发明的最佳方式。对于阅读了前述说明书的本领域普通技术人员来说，那些优选实施方式的变通方式可以是显而易见的。本发明人期望本领域技术人员适当地使用这种变化，并且发明人旨在以与本文具体描述的不同的方式实施本发明。因此，本发明包括随后附具的权利要求中所述主题的所有适用法律准许的改变和等同实施。而且，本发明包括以上所述要素的所有可能的变通方式的任意组合，除非在本申请中另有说明或者与上下文明显矛盾。<110>三星电子株式会社<120>包含增加2-卤酸脱卤酶活性的基因修饰的重组微生物以及通过使用其降低样品中氟化甲烷浓度的方法<130>px052559ov<160>24<170>kopatentin2.0<210>1<211>231<212>prt<213>蜡状芽孢杆菌<400>1metmetglytyrlysalametleupheaspleuaspaspthrleuleu151015aspargasplysalavalglualaleupheleuilevalleuglulys202530cystyrgluasnvalaspglyalaalalysserasnmetleuglnlys354045phelysglutyrasplysargglutyrglyileserasnlysthrthr505560valleugluserleupheaspgluphethrproargtyrargleupro65707580argasntyrileglnaspphetrpasnasnasnpheproargcysphe859095serileaspglnasnthrilehispheleuasnglnilelyslyshis100105110cyslysvalglyileilethrasnglyserthrglnargglnlysala115120125lysilepheasnthrasnleuasnlystyrphegluthrileileile130135140serglugluvalglypheserlysproasplysargilephegluleu145150155160alaleuasnlysleuasnleuglnprogluasnthrleuphevalgly165170175aspaspleuglulysaspilealaglyproglnasnalaasnilelys180185190glyvaltrppheasnproglnlysilelysasnthrthrlysilegln195200205protyralagluileasnthrleuaspserleuleusertyrvalthr210215220proglntyrphetyrasnlys225230<210>2<211>696<212>dna<213>蜡状芽孢杆菌<400>2atgatgggttataaagcgatgctgtttgatttagatgatacattacttgatagggataaa60gcagtagaggcattatttttaattgttttagaaaagtgttatgaaaatgtagatggtgcg120gctaaaagcaacatgttacagaaattcaaagaatacgataaaagagaatatggtataagt180aataaaacgacagttttagaatcattgtttgatgaattcacgccaaggtatagattgcca240cgcaattacatccaagatttttggaataataatttccctagatgtttttcaatagaccaa300aatactattcatttcttaaatcaaataaagaagcactgtaaagttggaattataacaaat360ggctcaactcagaggcaaaaagctaaaatatttaacacgaatttaaataagtattttgaa420acaatcattatttctgaagaagtgggatttagtaaacctgataaacgtatattcgaacta480gcattaaataagttaaatttacaaccggaaaatactttattcgttggggatgacttagaa540aaggatattgctggtcctcaaaatgcaaatataaaaggtgtgtggtttaaccctcagaaa600atcaagaatactaccaaaatacaaccatatgccgagattaacactttggatagtttgtta660agttatgttactccacaatatttttataacaagtaa696<210>3<211>236<212>prt<213>蜡状芽孢杆菌<400>3metlystyrlysvalileleupheaspvalaspaspthrleuleuasp151015pheprogluthrgluarghisalaleuhisasnalaphevalglnphe202530aspmetprothrglytyrasnasptyrleualasertyrlysgluile354045serasnglyleutrpargaspleugluasnlysmetilethrleuser505560gluleualavalaspargpheargglnleuphealaleuhisasnile65707580aspvalaspalaglnglnpheseraspvaltyrleugluasnleugly859095lysgluvalhisleuilegluglyalavalglnleucysgluasnleu100105110glnaspcyslysleuglyileilethrasnglytyrthrlysvalgln115120125glnserargileglyasnserproleucysasnphepheasphisile130135140ileileserglugluvalglyhisglnlysproalaarggluilephe145150155160asptyralapheglulyspheglyilethrasplysserservalleu165170175metvalglyaspserleuthrseraspmetlysglyglygluasptyr180185190glyileaspthrcystrptyrasnproserleulysgluasnglythr195200205aspvalasnprothrtyrgluvalgluserleuleuglnileleuglu210215220ilevalgluvalalagluglulysvalalaserphe225230235<210>4<211>711<212>dna<213>蜡状芽孢杆菌<400>4atgaaatacaaagttatattattcgacgtagatgatacattattagatttccctgaaacg60gaaagacacgcattacataatgcgtttgtacagtttgatatgcctacagggtataatgat120tatcttgcaagctataaagagattagtaatggattatggagagatttagaaaataaaatg180attacgctaagtgaattagcagtagatcgatttagacaattatttgcacttcataatata240gacgtagatgcacagcaatttagtgatgtataccttgaaaatttagggaaggaagtacat300cttatagaaggcgcagtacaattatgtgaaaatctacaagattgcaagttaggtattatt360acgaatggatatacgaaggtgcaacaatcaagaatcggaaattcacctttatgtaatttc420tttgatcacattattatttctgaagaagttggtcatcaaaaaccagcacgtgagattttt480gattatgcgtttgagaagtttgggattactgataaatcaagcgtactaatggttggagat540tcgttaacttctgatatgaaaggcggagaagattacggcattgatacgtgttggtataat600ccgagtttgaaagaaaacgggacagatgttaacccgacttatgaagtggagagtctgctc660caaattttagaaattgtagaagtggcggaagaaaaggtagcttcattttaa711<210>5<211>231<212>prt<213>蜡状芽孢杆菌<400>5metlyslystyrlysthrleuleupheaspvalaspaspthrleuleu151015asppheglnlysalaglulysvalalaleuargvalleuphegluglu202530lysglyileproleuthraspgluileglualaargtyrlyslysile354045asnlysglyleutrpaspalapheglulysglygluleuserargasn505560gluvalvalasnthrargpheserleuleuphelysglutyrglyglu65707580gluvalasnglyileleuphegluasnasntyrargasntyrleuglu859095gluglyasnglnleumetglnglyalapheglupheileasnglnile100105110glnglyglutyrgluleutyrilevalthrasnglyvalserlysthr115120125glnasplysargleuargasnalaglyleuhisserleuphelysasp130135140valphevalsergluaspthrglypheglnlysprometlysglutyr145150155160pheasptyrvalphegluargileproasnphealaprogluglugly165170175leuileileglyaspserleuseralaaspilelysglyglytyrval180185190alaglyileaspthrcystrppheasnprogluarglysleuasnasp195200205serglyileileprothrtyrgluvalhisasnpheglugluleuglu210215220alaleuleulysglnhisval225230<210>6<211>696<212>dna<213>蜡状芽孢杆菌<400>6atgaaaaaatataaaacattgctatttgatgtagatgatacattattagatttccaaaag60gctgaaaaagtggctttacgggtgctttttgaagagaagggaatccctttaacagacgag120atagaggctcgttataaaaagataaataaaggtctttgggatgcttttgaaaaaggtgaa180ctatcacgcaatgaagttgtaaatacacgattctctctgttgtttaaagagtatggagaa240gaagtaaatggaatattattcgaaaataattatcgtaactacttagaagaaggaaatcaa300ctcatgcaaggtgcatttgaatttataaatcaaattcaagg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