一种检测药物性耳聋的PCR荧光分子信标探针的制作方法

本发明的属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种检测药物性耳聋的pcr荧光分子信标探针。

背景技术：

耳聋是最常见的残疾之一，严重影响了患者的生活质量，给个人和家庭带来沉重的负担。2006年我国第二次残疾人抽样调查结果显示，全国残疾人总数达8000多万，而其中多重残疾患者中伴随听力障碍的为776万^[1]。而耳聋中的50％～70％可能与遗传因素有关^[2]。耳聋也与环境因素有关，出生前后的感染、声音过大和大脑创伤的耳蜗的影响、药物毒性如氨基糖甙类抗生素等，这些环境因素结合遗传因素，共同导致了耳聋的发生^[3]。氨基糖甙类抗生素在耳蜗毛细胞中的主要积聚部位是线粒体和溶酶体，且代谢缓慢，从而对听力产生伤害^[4]。1993年，prezant等人通过对患病家族线粒体基因序列分析,首次报道了线粒体12srrna上a1555g突变与药物性耳聋的关系^[5]；2004年，zhao等人首次在一个汉族家系中发现了c1494t突变与药物性耳聋的相关性^[6]。

目前的检测方法主要采用测序法^[7]、pcr-rflp法^[8][9]、基因芯片法^[10]和高分辨率熔解曲线法^[11]。但是这些方法都有一些局限性。其中，测序法和基因芯片法都需要特定的仪器和试剂盒，成本高，不利于在欠发达地区推广使用。pcr-rflp法必须先进行pcr扩增后再对产物进行开盖处理，有可能产生污染而出现假阳性结果。高分辨率熔解曲线法野生型和突变型之间tm值之差较小，容易造成误判，且难以实现在一个反应中进行两个位点的检测。因此，目前急需一种低成本、操作简便、结果准确明显、易于推广的技术，实现在单管反应中，同时对药物性耳聋相关位点12srrna的c1494t、a1555g突变进行检测。

1996年，tyagi和kramer发明了分子信标(molecularbeacon)^[12]，这种荧光探针能特异性的识别靶序列，在与之杂交之后发生构象变化，发出荧光，而没有与靶序列杂交的探针会形成茎环结构，荧光基团与淬灭基团发生自淬灭，从而降低了背景信号。同时，由于分子信标能够标记多种荧光基团，从而便于实现多重检测。分子信标技术背景信号低，灵敏度高，特异性好，操作简便，可以用于活体分析等优点，使其在临床诊断中有着非常广泛的应用价值。本发明就是基于荧光分子信标探针进行设计的。

[1]第二次残疾人抽样调查办公室.全国第二次残疾人抽样调查主数据手册[m].北京:华夏出版社,2007,2:38.

[2]marcollaa,bouchetemblep,leroseyy,mariejp,dehesdind.geneticdeafness.annotolaryngolchircervicofac,2006,123(3):143–147.

[3]petitc,levilliersj,hardelinjp(2001)moleculargeneticsofhearingloss.annurevgenet35:589–646

[4]丁大连,richardsalvi.氨基糖苷类抗生素耳毒性研究[j].中华耳科学杂志,2007(02):125-131.

[5]prezanttr,agapianjv,bohlmanmc,etal.mitochondrialribosomalrnamutationassociatedwithbothantibiotic-inducedandnon-syndromicdeafness.[j].naturegenetics,1993,4(3):289-294.

[6]zhaoh,lir,wangq,etal.maternallyinheritedaminoglycoside-inducedandnonsyndromicdeafnessisassociatedwiththenovelc1494tmutationinthemitochondrial12srrnageneinalargechinesefamily[j].americanjournalofhumangenetics,2004,74(1):139-52.

[7]林文津,郭舜民,徐榕青,等.荧光定量pcr法检测线粒体基因a1555g与c1494t突变[j].中国医药导报,2013,10(28):159-161.

[8]刘振,虞幼军,王跃建,等.佛山地区耳聋儿童gjb2235delc突变和线粒体dnaa1555g突变的研究[j].中华耳科学杂志,2006(3):227-230.

[9]luispablog,maríaeugeniaf,rosauracarone,etal.carrierfrequencyofthe35delganda1555gdeafnessmutationsintheargentineanpopulation.impactonthenewbornhearingscreening.[j].internationaljournalofpediatricotorhinolaryngology,2007,71(4):639–643.

[10]王国建,戴朴,韩东一,等.基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究[j].中华耳科学杂志,2008(1):61-66.

[11]余剑敏,沈智君,肖薇薇.线粒体基因a1555g和c1494t突变检测试剂盒临床应用研究[j].山西医药杂志,2011(12):1189-1190.

[12]tyagis,,kramerfr.molecularbeacons:probesthatfluoresceuponhybridization.[j].naturebiotechnology,1996,14(3):303-308.。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有方法的缺陷，提供一种针对氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g单核苷酸多态性一管多重检测方法，以实现同时对这两个位点便捷、准确、低成本的检测。

本发明是按如下技术方案实现的：

一种药物性耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：

a、在12srrna基因上1494、1555位点的上下游设计并合成一对引物，其产生的靶序列为200bp；

b、分别针对1494和1555两个位点，设计合成分子信标探针，探针覆盖所检测位点，1494位点在5’末端标记fam荧光基团，1555位点在5’末端标记hex荧光基团，两个探针的3’末端采用bhq1淬灭基团；

c、提取待测标本中的dna，使用步骤a中的引物、步骤b中的探针，与其他pcr反应体系成分混合，进行pcr反应，扩增靶基因片段；

d、反应结束后，进行一次高分辨率熔解曲线分析，根据fam和hex通道熔解曲线中熔解峰的位置，分别对待测标本dna在1494和1555两个位点的基因型进行分析。

本发明方法的pcr反应体系与常规pcr反应体系相似，包括聚合酶(taq)、dntps、缓冲体系、引物、探针及模板。体系包含二重反应，每管同时检测两个位点，采用不对称扩增的方式，便于后续探针的杂交。

靶序列(seqidno.1)为：

1gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccg

51tcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgc

101atttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgc

151acttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt

所述的引物序列为：

引物1(seqidno.2)：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2(seqidno.3)：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

所述的荧光分子信标探针序列为

探针1(seqidno.4)：5’cccgtcaccctcctcaagtatacggg3’；

探针2(seqidno.5)：5’cccgaggagacaagtcgtaacatcggg3’；

本发明方法中的阴性对照可以选用双蒸水。

本发明方法的pcr反应在rochelightcycler96荧光实时pcr仪，本发明中pcr反应采用三步法，pcr扩增温度条件如下：95℃预变性300s，扩增为三步法：每个循环95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，共45循环，循环结束后在72℃延伸300s。扩增结束后即进行熔解曲线检测，选择的检测通道为fam和hex，熔解过程为95℃退火60s，迅速冷却到45℃并保持60s，检测温度范围为45～95℃，每升高1℃采集15次荧光数据。熔解曲线使用pcr仪器对应软件进行分析。

本发明的基因分型采用荧光分子信标探针高分辨率熔解曲线分析，曲线的熔解峰值表示有一半双链解链时的温度，本发明中可以理解为单链与探针杂交时的tm值。其中

1494位点对应探针与野生型、突变型的熔解峰分别位于63℃和55℃，温度差为8℃，1555位点对应探针与野生型、突变型的熔解峰分别位于58℃和52℃，温度差为6℃。

本发明还涉及一种通过高分辨率熔解曲线分析检测氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变基因型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)扩增覆盖c1494t和a1555g突变区域的一组引物对，所述的引物对的序列如seqidno.2和seqidno.3所示

(2)两条分别特异性结合扩增的片段上相应的突变区的荧光分子信标探针，所述的探针的序列如seqidno.4和seqidno.5所示；

(3)必要的核酸扩增和杂交试剂。

本发明还涉及一组用于检测氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变的引物组和荧光分子信标探针，所述的引物组的核酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示；所述的荧光分子信标探针的核酸序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

本发明还涉及所述的引物组和荧光分子信标探针在检测氨基糖甙类抗生素诱导的非综合征型耳聋中的应用。

本发明针对药物性耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变检测的临床需求而设计，具有快速准确、操作简便、检测成本低等特点。突出特点在于利用了分子信标与不同基因型的靶序列杂交时有不同的tm值，通过高分辨率熔解曲线分辨tm值来将不同基因型分开。通过标记不同的荧光基团，可以在一个反应中实现多重检测。本发明的有益效果是：可以扩增出12srrna上药物性耳聋相关位点1494和1555附近的靶序列，并且实现灵敏准确的分型，可以据此判断患者是否携带这两个易感突变，从而指导临床的用药。检测手段采用荧光实时pcr方法，具有很高的灵敏度；体系使用分子信标，特异性好，背景信号低，能够多重检测。扩增和检测一次性完成，闭管反应避免交叉污染，操作简便快捷，有很高的临床应用价值。

附图说明

图1、荧光分子信标进行分型的原理图。图中显示本发明中实际引物、探针在靶序列上的分布情况。

图2、两个位点野生型和突变型的分型结果图，

[2a]：1494位点上探针1与野生型、突变型的熔解温度(tm)，其中，野生型退火温度为63℃，突变型退火温度为55℃，△tm为8℃；

[2b]：1555位点上探针2与野生型、突变型的熔解温度(tm)，其中，野生型退火温度为58℃，突变型寡退火温度为52℃，△tm为6℃。

具体实施方式

实施例1、药物性耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变检测试剂盒(荧光分子信标探针法)的组成

(1)靶序列为人12srrna编码基因上的一段，包含了待测的1494、1555位点及其前后共200bp的dna序列，荧光分子信标探针杂交区域均位于引物对之间，且分别覆盖对应的待测位点。

引物序列为：

引物1(seqidno.2)：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2(seqidno.3)：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

荧光分子信标探针序列为

探针1(seqidno.4)：5’cccgtcaccctcctcaagtatacggg3’；

探针2(seqidno.5)：5’cccgaggagacaagtcgtaacatcggg3’；

(2)试剂盒的配制过程如下：

配制pcr反应液：

每人份反应液：

实施例2、使用药物性耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变检测试剂盒(荧光分子信标探针法)双盲实验考察

样品采集

经过测序证实突变类型的基因组标本总计56份。样品由中国优生优育协会遗传与健康专家指导中心提供，为口腔黏膜样本，采用qiaampdnaminikit试剂盒，按照说明书进行dna的抽提。其中男13例，女43例，年龄2～59岁，包括汉族、蒙古族、维吾尔族等多个民族，采集了样本提供者的耳聋程度、氨基糖甙类药物史等信息。所有标本提供者均签署了知情同意书，操作均符合科研伦理。获得样品时仅有编号，并未获得对应的任何信息。获得样本后首先测定浓度进行质控，其中有4份样品由于浓度过低无法进行后续实验，因而不纳入考察，其余均为20ng/μl。

基因分型

按照上文中每人份反应液的体积和顺序，按照检测的总人数配制总管，配制完成后颠倒混匀，分装至每个pcr反应管中，分别加入待测模板，盖好管盖后放入rochelightcycler96荧光实时pcr仪，采用以下程序进行pcr反应：95℃预变性300s，扩增为三步法：每个循环95℃变性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，共45循环，循环结束后在72℃延伸300s。扩增结束后即进行熔解曲线检测，选择的检测通道为fam和hex，熔解过程为95℃退火60s，迅速冷却到45℃并保持60s，检测温度范围为45～95℃，每升高1℃采集15次荧光数据。熔解曲线使用pcr仪器对应软件进行分析。

结果

经过筛查，在52份质控合格的样品中，在1494位点上2个样品检测到突变型信号，其余为野生型；在1555位点上共有9个样品检测到突变型信号，其余均为野生型。将结果反馈至样品提供方，其经过核对后确认，检测结果与先前的测序的结论完全符合。

结论

荧光分子信标探针法采用较短的探针序列，从而将一个位点两个基因型之间的tm值差距拉大，能够实现更为明确的分型，避免了传统高分辨率熔解曲线法野生型与突变型峰值接近，难以判读的问题。荧光分子信标探针采用荧光基团进行标记，可以在不同的位点使用不同且互不干扰的荧光基团，从而实现多重检测，提高了检测效率。而分子信标探针独特的结构，使得探针在不与靶序列杂交时会发生自淬灭而没有荧光产生，相比于荧光染料其具有更低的背景，具有很高的灵敏度。本方法使用荧光实时pcr仪，而无需特殊仪器，全程闭管操作，避免了污染的风险，且一管反应检测两个位点，操作简便，便于其推广。以上结果表明，药物性耳聋相关位点12srrnac1494t、a1555g突变检测试剂盒(荧光分子信标法)适用于进行临床检测和用药指导，有很高的推广和应用价值。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。

sequencelisting

<110>上海泽因生物科技有限公司

<120>一种检测药物性耳聋的pcr荧光分子信标探针

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>200

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcct60

caagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaag120

tcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacac180

aaagcacccaacttacactt200

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gagtagagtgcttagttgaacaggg25

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aagtgtaagttgggtgctttgtg23

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cccgtcaccctcctcaagtatacggg26

<210>5

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cccgaggagacaagtcgtaacatcggg27