一种稳定表达抑癌基因REIC/Dkk3的人脐带间充质干细胞及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种具备间充质干细胞特性，并被抑癌基因REIC/Dkk3修饰的人脐带间充质干细胞及其构建方法及其制药用途。

背景技术：

Wnt信号通路作为一种在进化中高度保守的信号通路，在生长、发育、代谢等多种生物学过程中发挥重要作用。Wnt通路的失控与癌症也密切相关，国内外众多研究证明，Wnt/β-catenin信号通路异常活化在膀胱肿瘤的发生发展中起着重要作用。REIC/Dkk-3是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，国外已有研究证明，在膀胱肿瘤中，搭载REIC/Dkk-3基因的腺病毒能够显著地诱导肿瘤细胞凋亡，减缓肿瘤生长，并对多重耐药的肿瘤细胞也存在有效作用，这让我们看到了REIC/Dkk-3基因用于肿瘤靶向治疗的潜力。

随着对肿瘤发生发展分子机制认识的深入，人们已普遍意识到肿瘤是一种基因病，纠正发生缺陷的基因可为肿瘤的治疗提供新的希望。肿瘤基因治疗的临床研究开展已将近20年，基因治疗药物经历了从裸露DNA、非病毒载体基因药物到病毒类基因药物的发展过程。1995年之后，病毒载体由于转导效率较高且可用于体内和体外的基因转导，逐渐成为基因治疗研究和临床应用的主要工具，最主要的病毒载体有腺病毒及慢病毒，其中慢病毒载体较腺病毒载体相比，慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因可整合至靶细胞基因组并长期表达且免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此成为理想的基因转移载体。

综上可见搭载REIC/Dkk-3的慢病毒载体(Ad-REIC)有望成为体内基因治疗的有效载体，但该载体仍缺乏针对肿瘤细胞的靶向迁移能力和趋向性，而间充质干细胞(MSCs)不仅是基因的理想载体，而具有良好的肿瘤组织定向趋化能力，是肿瘤基因治疗的研究热点，因此借助基因工程技术构建REIC/Dkk3修饰的脐带间充质干细胞，以达到靶向治疗膀胱肿瘤的目的。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种表达抑癌基因REIC/Dkk-3的人脐带间充质干细胞的构建方法。

本发明的第二个目的是，提供如上所述表达抑癌基因REIC/Dkk-3的人脐带间充质干细胞的制药用途。

本发明的第三个目的是，提供一种用于靶向治疗膀胱肿瘤的药物组合物/试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种表达抑癌基因REIC/Dkk-3的人脐带间充质干细胞的构建方法，所述方法利用携带REIC/Dkk-3的慢病毒感染人脐带间充质干细胞，使人脐带间充质干细胞持续稳定表达REIC/Dkk-3，具体包括如下步骤：

(1)表达REIC/Dkk-3的慢病毒载体构建：根据GeneBank已有的REIC/Dkk-3的基因序列，设计扩增引物，提取总RNA，经聚合酶链式反应PCR合成得到REIC/Dkk-3的基因片段，酶切载体GV208，建立PCR产物线性表达载体，进一步转化抽提质粒，共转染包装细胞293T细胞，出现强绿色荧光并有细胞融合现象时，收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，并测定病毒滴度；

(2)人脐带间充质干细胞的培养：取足月正常妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以PBS充分洗涤，剔除脐动、静脉，以α-MEM原代培养人脐带间充质干细胞，对分离培养的细胞进行表型鉴定，并置37℃、5％CO₂，饱和湿度培养箱，待细胞80％融合时，胰酶消化1:3传代，连续培养至3代后采用流式细胞学技术检测细胞表面标志物；

(3)重组慢病毒转染人脐带间充质干细胞及鉴定：将携带REIC/Dkk-3基因的重组慢病毒转染入人脐带间充质干细胞，通过实时定量PCR及蛋白质印迹检测法检测REIC/Dkk-3表达情况，使人脐带间充质干细胞持续稳定表达REIC/Dkk-3，并用GFP标记。

进一步，所述引物序列如下：

上游引物为：5’－GTAAGTTTCCCCTCTGGCTTG－3’

下游引物为：5’－AAGCACCAGACTGTGAAGCCT－3’。

进一步，所述构建方法还包括如下步骤：

REIC/Dkk-3修饰的HUC-MSCs构建及鉴定：取对数生长期的P2代HUC-MSCs，Triple消化、离心后将细胞重选，调整细胞密度至约4×10⁴/ml，培养12小时；待细胞贴壁完成后，观察细胞融合度，当细胞融合度达到约40％-50％后即可加入慢病毒溶液，保证转染3天后细胞贴满整个12孔板底部，以便观察转染效率；采用上述构建并浓缩及鉴定后的慢病毒溶液，调整复感染指数(MOI)控制在75；将间充质干细胞融合度达到40％-50％时的细胞培养基弃置，加入新鲜培养基300ul,取200ul新鲜培养基，加入适量病毒溶液，调节MOI至75-100后，均匀滴入12孔板各孔中，恒温摇床充分混匀，培养24小时后，将含有慢病毒的培养基弃置，更换新鲜培养基，继续培养2天后，观察细胞状态及荧光强度；以绿色荧光的表达水平作为慢病毒转染效率的考量指标。

进一步，所述构建方法还包括如下步骤：

(1)取足月正常妊娠剖宫产胎儿的脐带，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4℃保存；

(2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm³大小的组织块；

(3)加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞；

(4)生理盐水冲洗细胞3次，每次2000rpm，8min；

(5)用含10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x10⁶cells/ml，接种于T25培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％C0₂培养箱内培养；

(6)3天后全量换液，弃去未贴壁的细胞与杂质，以后根据细胞生长情况，观察致细胞80％融合时，胰酶消化1:3传代，连续培养至3代后采用流式细胞学技术再次检测细胞表面标志物。

进一步，所述脐带间充质干细胞有效表达REIC/Dkk-3，并对肿瘤存在趋向作用。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述表达抑癌基因REIC/Dkk-3的人脐带间充质干细胞的制药用途，所述药物用于制备人膀胱肿瘤靶向治疗药物。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于靶向治疗膀胱肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包括如上所述表达抑癌基因REIC/Dkk-3的人脐带间充质干细胞。

一种用于靶向治疗膀胱肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包括含有表达抑癌基因REIC/Dkk-3的表达载体、人脐带间充质干细胞或抗癌剂的前药。

本发明优点在于：

1、本发明制备的表达REIC/Dkk-3的人体脐带间充质干细胞既能拥有干细胞对肿瘤的靶向迁移功能，又很好的表达REIC/Dkk-3基因，以达到诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长的作用，是对膀胱肿瘤靶向治疗极具潜力的治疗载体。

2、本发明根据GenBank中REIC/Dkk-3的基因序列，运用PCR技术进行体外扩增以得到目的基因片段，利用重组技术将编码人REIC/Dkk-3的基因片段转入慢病毒载体中，构建含人REIC/Dkk-3的重组慢病毒载体，然后将该慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞。利用慢病毒载体在人脐带间充质干细胞内的复制，使人脐带间充质干细胞持续稳定表达REIC/Dkk-3。

附图说明

附图1为Dkk-3目的基因片段获取后电泳结果。

附图2为重组质粒构建PCR鉴定结果。

附图3为质粒转染293T细胞后目的蛋白表达WB鉴定。

附图4为质粒转染293T细胞后GFP荧光表达鉴定。

附图5为病毒浓缩后滴度鉴定结果。

附图6为转染MSCs后Dkk-3组与空载体对照组比较。

附图7为转染MSCs后Dkk-3表达量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1表达REIC/Dkk-3的慢病毒载体的构建

总RNA提取

运用Trizol法提取总RNA，具体步骤如下：

(1)样品处理：取100mg组织置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。

(2)加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。

(3)4℃离心，12000g×15min，取上清。

(4)加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。

(5)4℃离心，12000g×10min，弃上清。

(6)加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。

(7)晾干，加入适量的去离子水溶解(65℃促溶10-15min)。

逆转录合成cDNA，PCR扩增。

(1)反应体系：

总RNA 2ug

Oligo(dT)₁₅ 1μl

离心，70℃水浴10min后立即冰水浴，稍离心

(2)反应体系(总体系20μl)：

引物设计，PCR扩增

根据Genbank中REIC/Dkk-3的基因序列，设计引物，合成目的基因片段。

上游引物为：5’－GTAAGTTTCCCCTCTGGCTTG－3’

下游引物为：5’－AAGCACCAGACTGTGAAGCCT－3’

反应体系：

酶切载体GV208

酶切反应温度：37℃

酶切反应时间：2h

酶切反应体系：

重组质粒构建

(1)PCR产物交换入线性表达载体得到pGC-LV

反应体系(μL)：

制备感受态细胞

配置下述溶液：

(1)0.1M CaCl₂溶液，以0.22μm过滤除菌。

(2)250mM KCl₂溶液。

(3)2M MgCl₂溶液，高压灭菌。

(4)SOB:1ml 250mM KCl₂溶液加入100ml LB，以5M NaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl₂溶液。

用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞

(1)从于37℃培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100ml LB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转/分)。

(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃

(3)于4℃以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

(4)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

(5)以10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份沉淀，放置于冰浴上。

(6)于4℃，以4000转/分离心10分钟，回收细胞。

(7)倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽。

(8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀。

(9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。

转化

(1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μL转移到无菌的微量离心管中，每管加10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。

(2)将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟。

(4)每管加800μL LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。

(5)将150μL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

(6)将平板置于室温直至液体被吸收。

(7)倒置平皿，于37℃培养，16小时。

抽提pGC-LV质粒DNA，PCR扩增测序

挑选没有突变的菌落，抽提质粒。按照质粒抽提试剂盒说明书操作，实验步骤如下：

(1)将培养过夜的2ml菌液移至2ml离心管中，最高速离心30sec，弃尽上清；

(2)在细菌沉淀中加入250μl Solution1液，振荡至彻底悬浮；

(3)加入250μl Solution 2溶液，立即温和地上下翻转离心管5-10次以混匀，使菌体充分裂解直至形成透亮的溶液，此步骤应在5min内完成；

(4)加入400μl 4℃预冷的Solution 3溶液，立即温和并充分地翻转离心管5-10次以混匀，室温静置2min，最高速离心10min；

(5)将上清倒入新的离心管中，再次最高速离心10min；

(6)小心吸取上清转移到DNA吸附柱中(吸附柱置于废液收集管中)，离心1min，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；

(7)在吸附柱中加入500μlW1液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中；

(8)在吸附柱中加入700μl W2液，离心30sec，弃滤液，并将吸附柱置于同一收集管中，重复一次；

(9)最高速离心1min；

(10)将吸附柱移入新的干净的1.5ml离心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl预热到60℃的去离子水，室温静置1min，最高速离心1min，得到的即为质粒DNA溶液。PCR测序，反应条件如前，测序结果见图，通过GENBANK对照，碱基序列与REIC/Dkk-3基因完全一致。表明PCR扩增得到的目的基因完全正确。

慢病毒转染293T细胞及包装

(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×10⁷细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。

(2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。

(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5分钟。

(4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

(5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

(6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。

(7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

(8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。

(9)每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养48小时。

慢病毒的收获及浓缩

(1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。

(2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。

(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。

(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。

(5)组合好后，做好平衡，放在转头上。

(6)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。

(7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。

(8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。

(9)离心力不超过1000g,时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。

(10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

病毒滴度测定

荧光法测定滴度，步骤如下

(1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104个细胞，体积为100μl。

(2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基。

(3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。

(4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养。

(5)24小时后，加入完全培养基100μl。

(6)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

(7)根据荧光结果，计算病毒滴度。

实施例2人脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定

(1)经父母授权同意，取足月正常妊娠剖宫产胎儿的脐带，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4℃保存；

(2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm³大小的组织块；

(3)加入质量/体积比为0.1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞。

(4)生理盐水冲洗细胞3次，每次2000rpm，8min；

(5)用含10％FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x10⁶cells/ml，接种于T25培养瓶中，置于37℃、饱和湿度5％C0₂培养箱内培养；

(6)3天后全量换液，弃去未贴壁的细胞与杂质，以后根据细胞生长情况，观察致细胞80％融合时，胰酶消化1:3传代，连续培养至3代后采用流式细胞学技术再次检测细胞表面标志物，MSCs为高表达简称值细胞表面抗原CD44，CD90，CD105，低表达或者不表达造血前提细胞标志抗原CD34、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD19、单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。

实施例3重组慢病毒转染人脐带间充质干细胞及功能鉴定

(1)准备细胞：将培养的第三代人脐带间充质干细胞转至24孔板内，每个孔内细胞数在3～5×10⁴左右，铺板时细胞的融合率为50％左右，每孔培养基体积为100μl；进行病毒感染时细胞的融合度需为70％左右。

(2)将准备好的重组慢病毒从-80℃中取出，置于冰上融化。

(3)使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基，吸去原细胞培养器皿中的培养基，并在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液混匀后，放于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂)孵育过夜。

(4)感染后观察细胞状态，及时更换培养基，一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液。

(5)第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率。

(6)持续按照已述方法培养干细胞，western blotting鉴定，使其稳定表达REIC/Dkk-3后用GFP标记。

Western blotting检测REIC/Dkk-3表达

(1)常规蛋白电泳分离样品；

(2)PVDF膜用甲醇浸湿，去离子水冲洗，再转移到Transferring buffer中平衡20min，电泳胶置Transferringbuffer中平衡20min，裁4张与胶同样大小的Whatman3mm滤纸，置Transferringbuffer中平衡；

(3)按下列顺序装好blot：负极—2层滤纸—电泳胶—PVDF膜—2层滤纸—正极，在这一步，要注意PAGE胶上的预染Marker是否清楚，为了避免在转膜之后膜上的Marker不清楚，可以在这一步，当胶和膜叠在一起时，对应胶上的Marker，用圆珠笔在膜的相应位置做上记号；

(4)5％脱脂牛奶/PBST 20ml，水平摇床，室温封闭1h；也可以先室温封闭若干时间，4℃过夜；

(5)用PBST稀释一抗，5％BSA，稀释倍数：1000倍，将膜封在塑料袋中，不留气泡，用胶带固定在可垂直旋转的小摇床上，偏转角度70-80度，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用>4ml/cm²(膜面积)的PBST，室温洗15min；

(6)用PBST稀释二抗，5000倍或10000倍稀释5％BSA，水平摇床，室温1hr；先用PBST短暂地洗2次，再用>4ml/cm²(膜面积)的PBST，室温洗15min；

(7)将检测试剂(ECLplus)从4℃取出，在打开前平衡至室温，检测试剂的A液与B液以40:1的比例混合，检测试剂的用量为0.1ml/cm²；

(8)膜置于吸水纸上干燥，蛋白面朝上，检测试剂加在膜上，覆盖整个膜表面，室温2min；

(9)用镊子夹起PVDF膜，使膜的下边角搭在纸巾上，吸干多余的检测试剂；

(10)PVDF膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间10sec。

REIC/Dkk-3修饰的HUC-MSCs构建及鉴定

第一天，取对数生长期的P2代HUC-MSCs，Triple消化、离心后将细胞重选，调整细胞密度至约4×10⁴/ml，培养12小时。待细胞贴壁完成后，观察细胞融合度，当细胞融合度达到约40％-50％后即可加入慢病毒溶液，保证转染3天后细胞贴满整个12孔板底部，以便观察转染效率。采用上述构建并浓缩及鉴定后的慢病毒溶液，以不同感染复数(multiple of infection,MOI，分别为50、60、75、80、90、100)的重组慢病毒感染hUC-MSCs，通过EGFP的表达筛选最佳MOI。重组慢病毒载体转染hUC-MSCs后96h荧光倒置显微镜观察绿色荧光的表达情况。MOI值为75感染效率为80％以上，而75以上MOI值感染效率无明显升高，MOI＝90时感染效率反而下降，故最佳MOI值为75。选择MOI控制在75-100之间。将间充质干细胞融合度达到40％-50％时的细胞培养基弃置，加入新鲜培养基300ul，取200ul新鲜培养基，加入适量病毒溶液，调节MOI至75-100后，均匀滴入12孔板各孔中，恒温摇床充分混匀，培养24小时后，将含有慢病毒的培养基弃置，更换新鲜培养基，继续培养2天后，观察细胞状态及荧光强度。以绿色荧光的表达水平作为慢病毒转染效率的考量指标。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。