同时过表达R‑spondin1和Noggin的细胞株及其构建方法和应用与流程

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种共同过表达R-spondin1和Noggin细胞株(CHO-Rspon-Noggin)及其构建方法和在肠道干细胞培养中的应用。

背景技术：

R-spondin1作为R-spondin家族的一员，是一种分泌型蛋白，可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路促进肠腺上皮细胞分裂，加速肠腺及小肠绒毛的再生，从而保持小肠和大肠肠粘膜的完整性，也可以调节肠道隐窝的体外3D生长。 Noggin是BMP信号通路的抑制剂，在肠腔表面分化成熟的柱状上皮细胞中可以检测到BMP信号通路中的Smad1、Smad5和Smad8的表达，Noggin作为BMP信号通路抑制剂，可以维持肠道干细胞的干性。

肠道类器官或者说“迷你肠子”，是将提取的肠道隐窝或肿瘤组织在体外利用基质胶培养生长出与来源相似的类器官。类器官可以帮助我们进行肠道干细胞、肠道肿瘤发生发展以及肠道肿瘤治疗方式的研究，包括传统的放疗、化疗及生物靶向治疗，甚至新兴的基因治疗研究。但是类器官目前的培养主要依赖于价格高昂的商业化细胞因子（R-sponding1， Noggin等) ，从而造成整个培养费用太高，严重阻碍了类器官的研究和推广。本发明涉及的一种共同过表达R-spondin1和Noggin细胞株(即CHO-Rspon-Noggin)，能够同时分泌这两种细胞因子到培养上清中，并保持长时间有活性。该条件培养基能代替商业化的因子用于肠道类器官的培养，在类器官培养及后续研究中具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种同时过表达R-spondin1和Noggin的细胞株及其构建方法和应用，包括对R-spondin1和Noggin进行基因工程改造以及进行慢病毒包装和感染CHO细胞的方法，以及含R-spondin1和Noggin细胞因子的培养基上清液收集方法和该上清液在肠道干细胞培养中的应用。

本发明提供的能同时过表达R-spondin1和Noggin的细胞株，记为CHO-Rspon-Nog，能够同时过表达了人R-spondin1和人Noggin两个基因，能同时稳定分泌这R-spondin1和Noggin两个基因至其细胞培养上清液中，由该上清液配制的培养基能够稳定培养小鼠隐窝和人肠道正常隐窝及肿瘤组织。如图1、图2所示。

本发明提供的能同时过表达R-spondin1和Noggin的细胞株的构建方法，具体步骤包括：

包装pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin两个慢病毒，采用293T细胞作为工具细胞进行慢病毒的包装，辅助质粒选择psPAX和pMD2.G，质粒转染293T细胞48小时后收集细胞上清，也即慢病毒RsponV－GFP和NogginV－puro。RsponV－GFP感染CHO细胞，采用流式细胞分选术筛选GFP－Rspondin高表达的CHO－Rspon细胞，然后用NogginV－puro感染CHO－Rspon细胞，采用200ug/ml puromycin的筛选压力选择高表达Noggin CHO-Rspon-Noggin细胞，并且在mRNA和蛋白水平上进行过表达验证。如图3、图4所示。

本发明还提供两个慢病毒质粒pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin的构建和纯化方法，所述方法包括：人R-spondin1和人Noggin两个基因的慢病毒载体构建：选择EcoRI和BamHI两个酶切位点,将R-spondin1和Noggin两个基因CDS区扩增出来，其中：

PCR扩增R-spondin1基因的上游引物为R-spondin F（5’-CCGGAATTCATGCGGCTTGGGCTGTGTGT-3’（SEQ.ID.NO.1）,EcoRI）

PCR扩增R-spondin1基因的下游引物为R-spondin R（5’-GCGGGATCCCTAGGCAGGCCCTGCAGATG-3’ （SEQ.ID.NO.2）,BamHI）；

PCR扩增Noggin基因的上游引物为Noggin F（5’-CCGGAATTCATGGAGCGCTGCCCCAGCCT-3’ （SEQ.ID.NO.3）, EcoRI）；

PCR扩增Noggin基因的下游引物为Noggin R (5’- GCGGGATCCCTAGCACGAGCACTTGCACT-3’ （SEQ.ID.NO.4） ,BamHI)；

将这两个基因全长分别连接到表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin，采用大肠杆菌DH5α进行转化扩增质粒；并分别命名为pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-puromycin-Noggin。

本发明还提供上述细胞株（CHO-Rspon-Noggin）的应用。包括：

收集R-spondin1和Noggin两个细胞因子的方法，所述的方法包括正常培养CHO-Rspon-Noggin细胞，细胞生长到100%后按1:10比例传代，待细胞生长到100%后将培养基换成无血清的培养基，继续培养一周后收集培养基，用0.22um的滤器过滤培养液，于-80度保存。

采用CHO-Rspon-Nog细胞株收集的细胞上清液配制培养基，培养小鼠和人肠道隐窝及肿瘤组织的方法如下：配制含50%收集上清液的Advanced DMED/F12培养基，并加入其他细胞因子，进行小鼠肠道隐窝的3D培养；或配制含20%收集上清液的培养基，进行人肠道正常隐窝和肿瘤组织的3D培养。通过培养使两者生长成与来源相似的类器官组织--“迷你肠子”，然后对“迷你肠子”进行基因干扰，如过表达或敲除等，开展肠道干细胞的研究，以及肠道肿瘤的发生、发展、转移和预后的研究；或者采用药物或放射线等处理“迷你肠子”，进行肠道肿瘤的治疗包括化疗、放疗、靶向治疗等方面研究。因此CHO-Rspon-Noggin细胞株在“迷你肠子”培养及后续研究中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1 为CHO-Rspon-Nog细胞收集的上清液和商品化细胞因子培养的小鼠隐窝示意图。

图2为CHO-Rspon-Nog细胞收集的上清液培养的人肠道正常隐窝和肿瘤组织示意图。

图3 为CHO-Rspon-Nog细胞的mRNA水平表达情况示意图。

图4 为CHO-Rspon-Nog细胞的蛋白水平表达情况示意图。

具体实施方式

下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。

以下内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1：慢病毒载体pCDH-GFP-R-Spondin和pCDH-puromycin-Noggin的构建方法

通过高保真PCR的方法，选择EcoRI和BamHI两个酶切位点,将R-spondin1和Noggin两个基因CDS区扩增出来：

R-spondin的上游扩增引物是R-spondin F：（5’-CCGGAATTCATGCGGCTTGGGCTGTGTGT-3’,EcoRI）,

R-spondin的下游扩增引物是R-spondin R：（5’-GCGGGATCCCTAGGCAGGCCCTGCAGATG-3’,BamHI），

Noggin的上游扩增引物是Noggin F（5’-CCGGAATTCATGGAGCGCTGCCCCAGCCT-3’, EcoRI）,

Noggind的下游扩增引物是Noggin R (5’- GCGGGATCCCTAGCACGAGCACTTGCACT-3’,BamHI

然后用分子克隆方法将这两个基因全长分别克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin两个载体上，将重组载体转化到DH5α中，以氨苄西林为选择压力，转接重组菌株于含氨苄西林选择压力的LB固体培养基中，37℃培养12-16小时，挑选单个克隆的重组转接菌株至含氨苄西林选择压力的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时，抽提质粒后送测序，确定后R-spondin1和Noggin两个基因全长均分别克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin两个载体上，并分别命名为pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-puromycin-Noggin。

实施例2. 同时过表达R-spondin1和Noggin的CHO-Rspon-Noggin细胞株的构建方法

采用慢病毒感染方式构建CHO-Rspon-Noggin细胞，以293T细胞作为慢病毒包装细胞。待293T细胞生长至50-60%时，将目的基因质粒（分别是pCDH-GFP-Rspondin和pCDH-CMV-Noggin），包装质粒psPAX和pMD2.G按4:3:1的比例轻均匀加入293T细胞中，48小时之后收集293T细胞的病毒上清，分别命名为RsponV和NogginV，0.45um滤器过滤病毒上清供后续实验使用。

以CHO细胞为目的细胞，首先将含RsponV的病毒上清感染CHO细胞，通过流式分选术将GFP高表达的细胞筛选出来，此为高表达R-spondin1的CHO-Rspon细胞，然后再将含有NogginV的病毒上清感染CHO-Rspon细胞，通过200ug/ml puromycin的筛选压力选择高表达Noggin的CHO-Rspon-Noggin细胞，并采用Real-time PCR和Western Blotting两种方法,从mRNA和蛋白水平验证R-spondin1和Noggin的过表达情况。

实施例3. 收集含R-spondin1和Noggin两个细胞因子的培养基

含10%FBS和10ug/mlpuromycin的DMEM培养基培养CHO-Rspon-Noggin细胞，细胞生长到100%后按1:10比例传代，采用含10%FBS的DMEM培养基培养，待细胞生长到100%后将培养基换成含1%Glutamax和1%Hepes的Advanced DMED/F12无血清培养基，继续培养一周后收集细胞上清，用0.22um的滤器过滤细胞上清，并-80度保存。

实施例4. 含R-spondin1和Noggin两个细胞因子培养基的应用

收集小鼠隐窝，采用含100%收集的R-spondin1和Noggin上清液配制的培养基在基质胶中培养小鼠隐窝，小鼠隐窝能够生长成类器官组织----“迷你肠子”。

收集结肠癌患者大肠正常隐窝和肿瘤组织，用含20%收集的R-spondin1和Noggin上清液配制的培养基在基质胶中进行培养，同样能够生长成人的正常肠道类器官组织和人腺癌组织。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 同时过表达R-spondin1和Noggin的细胞株及其构建方法和应用

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