本发明涉及酵母基因工程领域，尤其涉及一种马克思克鲁维酵母质粒载体，能够在马克思克鲁维酵母中自主复制并用于内源或外源基因的表达。
背景技术：
马克思克鲁维酵母（kluyveromycesmarxianus）在分类学上与酿酒酵母具有一定的亲缘性，其能在40℃以上生长并进行乙醇发酵，并获得美国的gras和欧洲的qps安全认证。与酿酒酵母相比，马克思克鲁维酵母因其生长速率快、耐高温、可利用底物广泛和蛋白分泌能力强等优点而备受工业生产的青睐。为了能使马克思克鲁维酵母获得更加优良的性状，需要特定的载体对其进行分子生物学改造。
酵母的载体系统包括整合型载体、附加型载体、复制型载体和着丝粒载体等。整合型载体缺乏酵母的复制起始位点，不能在酵母中自主复制，但其具有整合介导区，可以整合到酵母染色体并稳定遗传。附加型载体通常含有酿酒酵母2μ质粒的dna复制相关序列，拷贝数高达60-100，转化效率高。复制型质粒含有源于酵母染色体的自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ars），ars含有酵母中dna进行双向复制所必须的信号，使这种载体能在酵母染色体外自主复制，拷贝数可达上百个，且转化效率也较高。着丝粒载体含有酵母染色体着丝粒的dna片段cen，cen是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点。着丝粒载体在细胞分裂过程中，在母细胞和子细胞之间平均分配，表现出高度的稳定性。
作为模式生物，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）拥有丰富的载体系统。虽然马克思克鲁维酵母与酿酒酵母之间存在一定的亲缘关系，但酿酒酵母中的常用载体往往不能在马克思克鲁维酵母中正常使用。因此，提供一种可在马克思克鲁维酵母中稳定自主复制并用于内源或外源目的基因表达的质粒载体是本领域急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供了一种马克思克鲁维酵母质粒载体，其可在马克思克鲁维酵母中自主复制并用于内源或外源目的基因的表达，所述质粒载体含有马克思克鲁维酵母自主复制和着丝粒dna序列cen/ars，如seqidno.1所示。
在一个实施方案中，启动子为adh1启动子，终止子为adh1终止子。
在一个实施方案中，所述质粒载体包含选择性标记，优选g418抗性基因kanmx6。
在一个优选实施方案中，所述质粒载体的核酸序列如seqidno.2所示。
在另一个实施方案中，所述质粒载体还包含目的基因。
在一个优选实施方案中，所述目的基因构建在adh1启动子与adh1终止子之间的一个限制性酶切位点上或者构建在adh1启动子与adh1终止子之间的两个限制性酶切位点（例如smai和xhoi）之间。
在一个更优选的实施方案中，所述adh1启动子与目的基因之间还包含kozak序列gccacc。
本发明还提供所述马克思克鲁维酵母质粒载体用于目的基因在酵母中表达的应用。
在一个实施方案中，所述目的基因为绿色荧光蛋白基因。
本发明提供的马克思克鲁维酵母质粒载体可以在马克思克鲁维酵母中自主复制并用于內源或外源目的基因的表达。
附图说明
图1是pkmlp2质粒图谱。
图2是表达gfp马克斯克鲁维酵母的明场与荧光显微图像。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作出详细说明，但本发明不限于以下实施例所述的技术方案。
实施例：绿色荧光蛋白gfp在马克思克鲁维酵母中的表达。
1)根据所述载体pkmlp2和gfp基因序列，分别设计pcr引物gfp-f(seqidno.3)和gfp-r(seqidno.4)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及说明见下表：
注：下划线标注的序列为限制性内切酶识别位点；小写字母序列为kozak序列。
2)以gfp-f和gfp-r为引物，含有gfp基因的大肠杆菌质粒puc19-gfp为模板（puc19-gfp质粒来采购自生工生物工程(上海)股份有限公司，绿色荧光蛋白gfp编码基因序列由该公司合成并构建入puc19质粒），pcr扩增得到扩增产物片段gfp/sx（seqidno.5），其5’端含有smai酶切位点和kozak序列(seqidno.6)，3’端含有xhoi酶切位点；
3)使用smai和xhoi限制性内切酶对所述载体pkmlp2和片段gfp/sx进行双酶切，分别纯化后使用t4dna连接酶将gfp/sx连接入线性化的pkmlp2，连接产物为pkmlp2-gfp；
4)将上一步的连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板上，在37℃下培养出单克隆后，提取质粒pkmlp2-gfp；
5)将pkmlp2-gfp电击转化马克思克鲁维酵母，涂布于含有200μg/mlg418硫酸盐的ypd平板上，30℃培养48h；
6)挑取平板上的马克思克鲁维酵母单克隆，用无菌水稀释后，使用荧光显微镜观察马克思克鲁维酵母所表达gfp的绿色荧光，结果如图2所示。图2中，细胞发出绿色荧光，说明gfp在马克思克鲁维酵母中正常表达。
序列表
<110>清华大学
<120>一种马克思克鲁维酵母质粒载体及其应用
<130>
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1274
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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