本发明属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法。
背景技术：
中性红细胞毒性法具有简便、快捷、灵敏等特点，是目前应用较多的检测细胞毒性的方法。国际烟草科学研究合作中心coresta组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用中性红细胞毒性试验对卷烟烟气冷凝物潜在的细胞毒性进行检测，该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。
烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟（如胶基型嚼烟）。胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型嚼烟自身特点建立适合胶基型嚼烟的细胞毒性试验检测方法，确保产品的安全性。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，评价胶基型嚼烟的安全性，提供一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，该方法是在传统卷烟制品细胞毒性试验方法的基础上改进得到的一种适合于胶基型嚼烟细胞毒性检测的试验方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10ml；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞hok于37℃、5%co2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用ph值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2ml，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0～1.5×105个/ml，再按接种量为200μl/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；
移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多个复孔，同时空白对照组相应的孔内要求无细胞；在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加200μg/ml的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；
步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱中孵育24h；
步骤（7），染料孵育：在步骤（6）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/ml的中性红溶液200μl/孔，再置于37℃、5%co2培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μl/孔，固定1min后移除甲醛溶液，之后加入配制好的中性红萃取液200μl/孔，之后振荡10min；
所述的中性红萃取液由无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按照体积比为50:1:49比例配制而成；
步骤（8），测定吸光值：将步骤（7）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下检测吸光值；
步骤（9），计算细胞抑制率：根据步骤（8）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：
式中：
当odn为阳性对照组多孔平均的吸光值时，x为阳性对照组的细胞抑制率；当odn为检测样品组某一浓度多孔平均的吸光值时，x为检测样品该浓度下的细胞抑制率；
odo——步骤（8）所得空白对照组多孔平均的吸光值；
odc——步骤（8）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；
首先，计算阳性对照组的细胞抑制率；当阳性对照组的细胞抑制率不大于90%时，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（8）进行试验；当阳性对照组的细胞抑制率大于90%时，则表明试验有效，然后计算检测样品组各浓度下的细胞抑制率并绘制细胞抑制率-浓度的曲线，所得曲线表征该胶基型嚼烟细胞毒性。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。
进一步，优选的是，步骤（4）所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
进一步，优选的是，步骤（4）中，在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%。
进一步，优选的是，步骤（5）分组时，检测样品组的各个浓度、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组均设置8个复孔。
进一步，优选的是，步骤（7）所述的振荡是在微孔板振荡器中进行，转速为1000rpm。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明是在口含烟制品细胞毒性的检测方法基础上进行的改进，与口含烟制品细胞毒性的检测方法相比较，口含烟制品前处理模拟含烟叶原料的snus型口含烟含服型的使用方法，为37℃下静置萃取，适合于snus型口含烟的，而胶基型嚼烟是以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品，37℃下静置萃取与其咀嚼的使用方式相差较大，无法有效的模拟其真实的使用状态。因此，本发明通过综合考察胶基型嚼烟制品的暴露途径、作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔角质细胞hok作为胶基型嚼烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟制品的细胞毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟制品的细胞毒性。
附图说明
图1为细胞抑制率曲线图。
.具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所采用的口腔角质细胞培养基okm、磷酸缓冲液均为普通的商品化产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例为体积比。
实施例1
一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10ml；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞hok于37℃、5%co2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～82%时移除培养基，用ph值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1ml，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.0×105个/ml，再按接种量为200μl/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；
移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多个复孔，同时空白对照组相应的孔内要求无细胞；在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加200μg/ml的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；
步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱中孵育24h；
步骤（7），染料孵育：在步骤（6）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/ml的中性红溶液200μl/孔，再置于37℃、5%co2培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μl/孔，固定1min后移除甲醛溶液，之后加入配制好的中性红萃取液200μl/孔，之后振荡10min；
所述的中性红萃取液由无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按照体积比为50:1:49比例配制而成；
步骤（8），测定吸光值：将步骤（7）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下检测吸光值；
步骤（9），计算细胞抑制率：根据步骤（8）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：
式中：
当odn为阳性对照组多孔平均的吸光值时，x为阳性对照组的细胞抑制率；当odn为检测样品组某一浓度多孔平均的吸光值时，x为检测样品该浓度下的细胞抑制率；
odo——步骤（8）所得空白对照组多孔平均的吸光值；
odc——步骤（8）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；
首先，计算阳性对照组的细胞抑制率；当阳性对照组的细胞抑制率不大于90%时，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（8）进行试验；当阳性对照组的细胞抑制率大于90%时，则表明试验有效，然后计算检测样品组各浓度下的细胞抑制率并绘制细胞抑制率-浓度的曲线，所得曲线表征该胶基型嚼烟细胞毒性。
实施例2
一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10ml；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞hok于37℃、5%co2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为88～90%时移除培养基，用ph值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液2ml，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.5×105个/ml，再按接种量为200μl/孔接种到96孔细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；
移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多个复孔，同时空白对照组相应的孔内要求无细胞；在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加200μg/ml的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和不同剂量步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度在大于0%、小于等于60%的范围内；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；
步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱中孵育24h；
步骤（7），染料孵育：在步骤（6）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/ml的中性红溶液200μl/孔，再置于37℃、5%co2培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μl/孔，固定1min后移除甲醛溶液，之后加入配制好的中性红萃取液200μl/孔，之后振荡10min；
所述的中性红萃取液由无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按照体积比为50:1:49比例配制而成；
步骤（8），测定吸光值：将步骤（7）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下检测吸光值；
步骤（9），计算细胞抑制率：根据步骤（8）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：
式中：
当odn为阳性对照组多孔平均的吸光值时，x为阳性对照组的细胞抑制率；当odn为检测样品组某一浓度多孔平均的吸光值时，x为检测样品该浓度下的细胞抑制率；
odo——步骤（8）所得空白对照组多孔平均的吸光值；
odc——步骤（8）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；
首先，计算阳性对照组的细胞抑制率；当阳性对照组的细胞抑制率不大于90%时，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（8）进行试验；当阳性对照组的细胞抑制率大于90%时，则表明试验有效，然后计算检测样品组各浓度下的细胞抑制率并绘制细胞抑制率-浓度的曲线，所得曲线表征该胶基型嚼烟细胞毒性。
其中，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min；所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。
实施例3
一种用于检测胶基型嚼烟细胞毒性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10ml；之后于37℃的恒温水浴锅中用研磨器研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞hok于37℃、5%co2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为83～87%时移除培养基，用ph值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1.5min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1.5ml，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至1.2×105个/ml，再按接种量为200μl/孔接种到96孔细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白对照组和细胞对照组加口腔角质细胞培养基；阳性对照组加200μg/ml的十二烷基硫酸钠溶液；检测样品组加不同剂量步骤（1）所得待测液；
移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组，每组多个复孔，同时空白对照组相应的孔内要求无细胞；在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加200μg/ml的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；
分组时，检测样品组的各个浓度、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组均设置8个复孔。
步骤（6），孵育受试物：将步骤（5）加样后的细胞培养板置于37℃、5%co2培养箱中孵育24h；
步骤（7），染料孵育：在步骤（6）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/ml的中性红溶液200μl/孔，再置于37℃、5%co2培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μl/孔，固定1min后移除甲醛溶液，之后加入配制好的中性红萃取液200μl/孔，之后在微孔板振荡器中1000rpm振荡10min；
所述的中性红萃取液由无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按照体积比为50:1:49比例配制而成；
步骤（8），测定吸光值：将步骤（7）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下（中性红法）检测吸光值；
步骤（9），计算细胞抑制率：根据步骤（8）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：
式中：
当odn为阳性对照组多孔平均的吸光值时，x为阳性对照组的细胞抑制率；当odn为检测样品组某一浓度多孔平均的吸光值时，x为检测样品该浓度下的细胞抑制率；
odo——步骤（8）所得空白对照组多孔平均的吸光值；
odc——步骤（8）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；
首先，计算阳性对照组的细胞抑制率；当阳性对照组的细胞抑制率不大于90%时，则表明试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（8）进行试验；当阳性对照组的细胞抑制率大于90%时，则表明试验有效，然后计算检测样品组各浓度下的细胞抑制率并绘制细胞抑制率-浓度的曲线，所得曲线表征该胶基型嚼烟细胞毒性。
其中，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min；所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤除渣，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌。
表1细胞毒性试验加样表
应用实例
采用本发明实施例3方法、201510193142.9方法分别对市售的三种胶基型嚼烟制品的细胞毒性进行检测，做两次平行实验，结果如表2所示。
表2三种胶基型型口含烟制品细胞毒性试验检测结果
其中，待测液浓度为0%时，为细胞对照组。
阳性对照组的细胞抑制率大于90%，证明试验体系有效、正常。
根据样品不同测试浓度下的细胞抑制率绘制细胞抑制率曲线。结果见图1所示。
由上表结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测用细胞、检测剂量条件下，三种胶基型嚼烟制品细胞抑制率与检测剂量间具有剂量效应关系，阳性对照细胞抑制率大于90%，证明本次试验体系正常，检测数据有效。而采用201510193142.9发明中适合于snus型口含烟的方法结果显示，在检测剂量范围内三种胶基型嚼烟制品细胞抑制率与检测剂量间无剂量效应关系，这可能是由于采用201510193142.9受试的三种胶基型嚼烟内含物释放不完全，不能真实反映其细胞毒性。
本发明所指的具有剂量效应关系为本领域内通用术语，即随着剂量的上升，抑制率有规律的增高或降低。
本发明是在口含烟制品细胞毒性的检测方法基础上进行的改进，与口含烟制品细胞毒性的检测方法相比较，口含烟制品前处理模拟含烟叶原料的snus型口含烟含服型的使用方法，为37℃下静置萃取，适合于snus型口含烟的，而胶基型嚼烟是以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品，37℃下静置萃取与其咀嚼的使用方式相差较大，无法有效的模拟其真实的使用状态。
本发明综合考察胶基型嚼烟制品的暴露途径、作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔角质细胞hok作为胶基型嚼烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟制品的细胞毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟制品的细胞毒性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。