一种用于单通道往复式循环荧光PCR研究的方法与流程

本发明涉及往复式循环单微通道PCR荧光检测装置的温度控制系统，主要用于研究不同单微通道内壁条件对PCR反应情况的影响，属于生物学、分析化学及医学检测领域。

背景技术：

空间飞行器内有危害微生物威胁航天员健康并腐蚀材料，急需空间在轨生物危害实时自动报警系统，其核心是微生物核酸荧光检测微系统。由于空间在轨要求设备具有全自动和微体积、小重量的技术特点。因此简化微流控荧光PCR工作系统是实现空间在轨生物危害实时自动报警系统要求的关键。

微流控荧光PCR工作系统的关键技术之一就是PCR试剂的扩增质量，PCR扩增需要使PCR试剂依次在高温区(高温变性阶段)，低温区(低温退火阶段)，适温区(适温延伸阶段)三个温度区域完成40个循环。目前市面上常见的荧光PCR检测仪，一般采用的工作方式是保持试剂位置不动，通过软硬件控制试剂温度在三个温区依次变化，并完成40个温度循环来实现PCR试剂的扩增，这类仪器体积较大、功耗较高，无法微型化设计，而且由于制冷和加热技术的制约，导致了PCR扩增的所需反应时间的变长。而对于实验研究中常见的PCR微流控芯片扩增方法，常见是方式是保持试剂三个温区温度不变，使微通道中的PCR试剂在三个温区内不断移动，经过40个循环后实现PCR扩增。扩增反应中所用的PCR扩增时间和PCR试剂用量上，都被40个微通道限制和浪费；此外由于40个微通道的温度循环结构很难构建相应一个微型加热和制冷的系统，相互循环中的不同温区相互制约甚至影响扩增反应结果，从而影响微型生物芯片的集成自动化控制与微型便携化。前期工作中我们已经设计了往复式单通道装置及方法，相比前面叙述的两种方式这种方式保留三个温区不变不动的基础上，使用将PCR试剂在往复式单微通道里移动的方法，这种方法结构简单，体积小，避开了PCR扩增中因制冷和加热技术的制约，节省了温度变化的时间，从而实现了在缩小系统体积的基础上又缩小了PCR扩增的时间，此方法已经取得授权。

为了进一步研究往复式单通道装置进行荧光检测时40个循环的过程，需要对比多个不同单通道条件(如内壁粗糙度)对PCR的扩增效率的影响，并对微通道内的分子挂壁现象进行研究，研究时面临问题如下：每个单通道PCR荧光检测装置的温控系统需要三个温度控制模块，每个模块都需要一个温度传感器，当对多个具有不同粗糙度的单通道PCR装置进行对比检测实验时，由于传感器本身具有误差范围，不能保证不同检测装置相同温区的温度绝对值相同，由于微通道对温度极其敏感，这种温度误差可能影响PCR试剂扩增结果，从而使对比失去意义。如需要同时对10套不同粗糙度的单通道PCR荧光检测装置进行对比实验时将需要30个温度传感器，每个传感器均有误差范围，此时粗糙度及温度都会影响PCR试剂扩增结果进而影响荧光检测结果。本发明就是设计一套试验方法，在保证相同温度的前提下实现对不同单通道中挂壁现象及荧光扩增过程的对比检测，此方法可以避免由于温度和检测装置的不同对PCR扩增检测结果的影响，使研究不同形貌微通道对PCR扩增结果的影响成为可能。

技术实现要素：

本发明涉及一种单通道往复式循环荧光PCR检测的研究方法，用于对比研究不同单通道中PCR40个循环中的扩增过程，为进一步实现功能集成、结构缩微、重量轻体积小全自动检测的目标打下基础。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种单通道往复式循环荧光PCR检测的研究方法，其特征在于：至少选用三块规格相同材质相同的金属块A、B、C，每个金属块大小为50*50*10mm以上，三个金属块上分别贴有加热膜，以实现对金属块每个温度控制；

三个金属块中心开孔；每个金属块开至少三个孔；

进行PCR反应的微通道从三个金属块开孔穿过，微通道直径为1mm，微通道与金属块孔之间的缝隙通过导热硅胶填充，H为激发光模块，I为检测光模块，激发光模块和检测光模块能够通过位移臂上下移动，通过上下移动依次完成对多个不同微通道PCR扩增情况的检测。

进一步，金属块的比热容高于0.46KJ/(kg·℃)。

进一步，金属块为钢块。

进一步，检测系统激发光模块包括470nm光源，470nm滤光片及聚光透镜。

进一步，检测光模块包括530nm滤光片，聚光透镜，光电转换部分。

进一步，控制A金属块温度为94℃，B金属块温度为56℃，C金属块温度为72℃，

本研究方案结构简单，体积小，为微型生物芯片的集成自动化控制与微型便携化提供参考。

附图说明

图1是单通道往复式循环荧光PCR研究方法示意图

图2是单通道往复式循环荧光PCR研究方法截面示意图

具体实施方式

其中A、B、C为三块规格相同材质的的金属块(比热容高于0.46KJ/(kg·℃)的金属块均可，本例采用钢块)，规格为50*50*10mm，三个金属块上贴有加热膜D、E、F，以实现对其温度控制，本方案中，控制A金属块(钢块)温度为94℃，B金属块(钢块)温度为56℃，C金属块(钢块)温度为72℃，三个金属块(钢块)中心开孔(图1只显示了三个孔，实际情况可以是多个孔)，进行PCR反应的微通道1、2、3从三个温区的金属块中心穿过，微通道直径为1mm，微通道与金属块孔之间的缝隙通过导热硅胶填充，从而控制微通道有效长度，H为检测系统激发光模块，主要由470nm光源，470nm滤光片及聚光透镜组成，I为检测系统检测光模块，其主要由530nm滤光片，聚光透镜，光电转换部分组成。激发光模块和检测光模块可以沿图示方向通过位移臂上下移动，检测光模块探测器位置同理可控制，来依次完成对多个不同微通道PCR扩增情况的检测。

优点：

相比目前常见两种PCR荧光检测方法而言本研究方法具有以下优势：1、本方案采用具有比较大热容的钢块作用在微通道上，其中钢块的比热容0.46KJ/(kg·℃)，PMMA比热容1.465KJ/(kg·℃)，石英比热容0.8kJ/(kg·℃)，本方案中微通道有效热量体积为0.157cm³，PMMA密度为1.18g/cm³，石英密度为1.18g/cm³，由以上数据可以得出每变化1℃钢块释放的热量约为9.1×10^-2KJ，而每变化1℃PMMA微通道与石英微通道需要消耗的热量约为2.7×10^-4KJ，远小于金属块释放的热量。由于金属块热容量足够大，放置微通道后对金属块温度的影响可以忽略不计，通过控制金属块的温度就可以实现对微通道的温度控制。这样在提高温度稳定性的同时保证了不同粗糙度单通道在进行PCR扩增时对应的每个温区温度一致。2、现有微流控芯片微通道一般采用在基底上连续刻蚀的方法实现，虽然可以完成微通道粗糙度改性，但是方法比较复杂，成本较高，改性程度不可控。本装置中的单通道改性较为简单(采用在微通道内壁制作UV胶涂层的方式改变内壁粗糙度)，改性程度相对可控(采用不同系列UV胶可得到不同的内壁粗糙度)。本方案采用通过改性PMMA得到的粗糙度分别为2.66μm，0.921μm，0.254μm的微通道进行试验，样品在微通道中的移动通过步进电机驱动活塞实现。最终通过检测模块得到的信号值分别为258,423,490，这说明在温度相同的时候不同粗糙度对扩增结果存在重要影响。