一种富含多糖类微生物基因组DNA的提取方法与流程

本发明涉及一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，适用于对DNA要求严格的三代测序技术，属于生物技术领域。

背景技术：

近年来，由于分子生物学技术和测序技术的发展为科研工作者研究微生物基因组序列、次级代谢产物的合成机理等提供了良好的基础，而微生物基因组的获得则是这些工作的基础。

微生物细胞壁成分复杂，富含荚膜多糖，培养过程中产生许多糖类和次生代谢物。微生物中糖的种类多样，有粘多糖、酸性多糖和中性糖等，这些糖类若在提取过程中不能去除干净的话，很容易污染DNA，降低DNA的纯度，这些多糖能抑制限制酶、连接酶和聚合酶等酶类的活性，严重影响后续测序数据的质量。

随着测序技术的高速发展，Pacific Bioscience的SMRT技术引起科研人员的广泛关注。该测序也是基于边合成边测序的原理，该项技术使用了Zero-Mode Wave guide(ZMW)(零级波导)。测序的过程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合(每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记)，被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。该技术对DNA的质量和纯度要求特别高，如DNA降解则造成数据量少，数据质量差，拼接效果不理想；DNA纯度不高，有糖或者盐类等物质污染会造成聚合酶活性降低甚至失活，造成实验成本的浪费。

以往针对多糖类微生物的基因组提取，只能使用试剂盒提取，但试剂盒昂贵，经过过柱也会有不同程度的打断，造成DNA不完整。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对现有多糖类微生物的基因组提取所存在的问题而提供一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，该方法简单易于操作，耗时短，成本较低，条带完整，能干净的去除多糖等杂质污染，适用于各种富含多糖类微生物基因组的提取。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul 2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

本发明的提取方法先将微生物的细胞壁破裂，而不破坏细胞核，释放出细胞质里的多糖，经离心后弃掉上清，然后用PBS反复清洗，以去除多糖，随后提取细胞核中的DNA，免去多糖对提取的干扰和对核酸的污染，提取出的DNA条带单一完整，纯度高，而且方法简便，已于操作，时间短，且成本低廉。

附图说明

图1和图2为使用本实验方法进行提取的电泳结果图。

图3为使用常规CTAB法提取的电泳结果图。

图4为使用QIAgen tissue&blood kit提取的电泳结果图。

图示说明：1-3：为金黄色葡萄球菌；4-5：铜绿假单胞杆菌；6-7：放线菌；8-9：水稻黄单孢菌；10-11：弧菌。

具体实施方式

实施例1

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量富含多糖类的金黄色葡萄球菌的菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul 2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

实施例2

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量富含多糖类的铜绿假单胞杆菌的菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul 2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

实施例3

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量富含多糖类的放线菌的菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul 2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

实施例4

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量富含多糖类的水稻黄单孢菌的菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul 2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

实施例5

一种富含多糖类的微生物基因DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)取适量富含多糖类的弧菌的菌体，加入1.5ml核酸分离缓冲液和20ul2-巯基乙醇，震荡混匀，置90℃水浴中10min，期间颠倒混匀几次；

2)取出，离心机中6000r/min离心10min，此时可看到大量多糖存在于溶液中；

3)用移液器轻轻吸出上清，注意不要吸到多糖；

4)加入1ml 1x PBS溶液，研磨仪上60Hz，震荡2s，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

5)重复4)步骤1次；

6)加入1ml 1x PBS溶液，用手震荡混匀，10000rpm离心2min，用枪轻柔吸弃上清；

7)重复步骤6)1次；

8)洗净上清后，加入500ul STES，震荡混匀，加入500ul酚氯仿，震荡30s；

9)12000rpm/min，离心5min；

10)小心转移上清至新的离心管中，加入5ul RNaseA，上下颠倒混匀后，室温放置5min；

11)加入50ul磁珠，500ul binding buffer，震荡混匀；

12)血液混匀仪上结合5min；

13)置于磁力架上，待上清澄清后，吸弃上清；

14)加入1ml 80％乙醇，静置30s后，去除乙醇；

15)短暂离心后，洗净乙醇，加入适量灭菌水，吹打混匀；

16)室温放置2min，放置在磁力架上，待上清澄清后，转移上清到新的离心管中。

上述实施例所提取的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞杆菌、放线菌、水稻黄单孢菌和弧菌电泳效果参见图1和图2。