本发明涉及中药材基因组DNA提取领域，具体涉及一种哈蟆油基因组DNA提取方法、试剂盒及其应用。
背景技术：
：中药鉴定是研究中药品种、质量，制定中药标准，寻找和扩大药源的前提和基础。中药四大传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与生物生长阶段和环境紧密相关的表现型，鉴定结果易受主观和客观因素影响。而基因组DNA序列是物种遗传本质决定的，也是不同生物的不可变“身份证”，这为动植物分类和鉴定提供了本质依据。DNA条形码(DNAbarcoding)技术是通过PCR技术扩增基因组序列中一段通用DNA片段，对PCR扩增的通用DNA片段进行比较分析完成物种快速、准确的识别和鉴定，在物种鉴定方面显示了广阔的应用前景。目前，利用COI序列对动物类药材进行鉴定已经取得了广泛的成功。但中国药典动物药材哈蟆油样本为不新鲜的干材样本，富含黏液质、胶质和半纤维素等物质，使用现有商品DNA提取试剂盒提取哈蟆油DNA时，在加入裂解液后哈蟆油药材高度膨胀，膨胀度高达55倍以上，水浴离心后无上清液或极少上清液，无法进行后续哈蟆油药材DNA提取步骤。此外，哈蟆油干材中基因组DNA片段化、氧化降解严重。所以，利用现有商品DNA提取试剂盒难以提取哈蟆油干材样本基因组DNA，从而无法进行后续的DNA条形码鉴定等工作。因此，本领域技术人员致力于开发一种获得高纯度基因组DNA的哈蟆油基因组DNA提取方法，以为该药材的DNA条形码鉴定及其他应用提供良好的基础。技术实现要素：有鉴于现有技术中哈蟆油基因组DNA提取时哈蟆油药材的高度膨胀、基因组DNA的片段化及氧化严重，难以有效提取基因组DNA的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种有效地、获得高纯度基因组DNA的哈蟆油基因组DNA提取方法。为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种哈蟆油基因组DNA提取方法，该方法包括以下步骤：1)取哈蟆油药材，加入缓冲液FB，研磨至无明显颗粒并混匀，其中，缓冲液FB为含酸活性水；2)加入缓冲液ATL和蛋白酶K，混匀，以裂解样品，其中，缓冲液ATL含十二烷基磺酸钠、甘氨酸和乙二胺四乙酸钠；3)加入缓冲液AL，混匀，其中，缓冲液AL含甘氨酸和乙二胺四乙酸钠；4)加入脂肪组织去除液：酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心获得第一上清液；5)在第一上清液中加入氯仿/异戊醇，混匀，离心获得第二上清液；6)在第二上清液中加入无水乙醇，混匀；7)将上一步所得溶液加入吸附柱中，离心；8)向吸附柱中加入缓冲液AW1，离心，其中，缓冲液AW1含盐酸胍和异丙醇；9)向吸附柱中加入缓冲液AW2，离心，其中，缓冲液AW2含叠氮钠和异丙醇；10)向吸附柱中加入TE或者ddH2O，离心获得DNA。进一步地，步骤1)中所述含酸活性水为含0.1％～2％盐酸的水。进一步地，步骤2)中缓冲液ATL为1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。优选地，步骤2)中裂解样品时，在56℃孵育至澄清。进一步地，步骤3)中缓冲液AL为10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。进一步地，步骤8)中缓冲液AW1含36％～50％盐酸胍和20％～50％异丙醇。进一步地，步骤9)中的缓冲液AW2含0.1％～1％叠氮钠和20％～50％异丙醇。本发明的第二方面提供了一种哈蟆油基因组DNA提取试剂盒，该试剂盒至少包括：对样品进行复性的含酸活性水；裂解样品的含十二烷基磺酸钠、甘氨酸和乙二胺四乙酸钠的缓冲液；含盐酸胍和异丙醇的洗涤液AW1及含叠氮钠和异丙醇的洗涤液AW2。进一步地，该试剂盒还包括研磨杵、吸附柱、收集管、蛋白酶K和缓冲液TE。本发明第三方面提供了上述哈蟆油基因组DNA提取方法或上述哈蟆油基因组DNA提取试剂盒在使用DNA条形码技术鉴定哈蟆油中的应用。本发明的优势在于，实现对哈蟆油药材，尤其是干燥哈蟆油药材的有效抽提从而获得高纯度基因组DNA。其中，使用含酸活性水实现了对哈蟆油组织的有效复性；联合脂肪组织去除液去除样本中的脂肪组织，减少对后续基因组DNA抽提的影响；使用本发明的抽提方法能使基因组DNA充分释放并实现高效纯化。具体地，含酸活性水使脂肪组织充分溶胀形成类似新鲜样品的结构，在十二烷基磺酸钠、甘氨酸和乙二胺四乙酸钠的作用下使组织细胞的蛋白质和基因组DNA结合的组蛋白充分变性，将蛋白酶K的效能发挥到最大，使基因组DNA样品结合到纯化柱后方便蛋白杂质被洗涤液洗脱下来。使用该方法，DNA提取浓度均达到50ng/μL以上，OD260/280达到或接近1.8～2.0之间，纯度较高。利用抽提获得的DNA，能实现DNA条形码鉴定技术100％的扩增成功率，这为DNA条形码技术得到更为广泛的应用提供了良好的基础。附图说明图1是采用本发明实施例2中提取获得DNA进行PCR扩增检测后的电泳图。其中，CK为PCR的阴性对照。具体实施方式以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。实施例1获得高纯度基因组DNA的哈蟆油药材基因组DNA提取方法确立哈蟆油药材基因组DNA提取标准方法，该提取方法为：1.取哈蟆油药材5mg，加入500μl缓冲液FB，研磨至无明显颗粒并混匀。其中缓冲液FB为含酸活性水，具体为含0.1％～2％盐酸的水。2.加入360μl缓冲液ATL和40μl蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋混匀，用以裂解样品。优选地使用涡旋混合仪混匀，56℃孵育至溶液澄清，每小时颠倒混合样品2～3次，或者使用水浴振荡器，通常1个小时可裂解完全。其中缓冲液ATL含1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。3.可选地，加入4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋混匀，室温放置2～5min，以去除RNA污染。4.加入400μl缓冲液AL，涡旋混匀，以促进DNA溶解于水相。其中缓冲液AL含10～20mM甘氨酸和10mmol乙二胺四乙酸钠。5.加入700μl脂肪组织去除液：酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，振荡混匀，离心获得上清液，去除脂肪及蛋白杂质。6.在上清液中加入700μl氯仿/异戊醇(24:1)，振荡混匀，离心获得上清液，从而去除残留的酚。7.上清液加入等体积无水乙醇，振荡混匀并静置，制造高盐环境，以促进后续基因组DNA和吸附柱的结合。8.将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，离心，丢弃废液和收集管。9.将吸附柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液AW1洗涤去除杂质，离心后丢弃废液和收集管。其中，缓冲液AW1含36％～50％盐酸胍和20％～50％异丙醇。10.将吸附柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液AW2洗涤去除杂质，离心后丢弃废液和收集管。其中，缓冲液AW2含0.1％～1％叠氮钠和20％～50％异丙醇。11.将吸附柱放入1.5ml离心管，向吸附柱中加入50μlTE或者ddH2O，离心获得DNA。实施例2大样本验证为了验证实施例1中确定的获得高纯度基因组DNA的哈蟆油基因组DNA提取方法、试剂组成及浓度的普遍有效性，利用多种哈蟆油样本，进行验证，具体为：1)实现对不同产地(黑龙江省、吉林省和辽宁省)的哈蟆油药材和中国药品生物制品检定所的标准对照哈蟆油药材进行DNA提取以获得高纯度基因组DNA。2)实现对不同商品规格(线油和块油)的哈蟆油药材进行DNA提取以获得高纯度基因组DNA。1.取哈蟆油药材约5mg，加入500μl缓冲液FB，使用研磨杵反复研磨30秒左右，至无明显颗粒并混匀。其中缓冲液FB为含酸活性水，具体为含0.1％～2％盐酸的水。其中，哈蟆油药材分别为：取材地点为黑龙江的样品：S1、S2、S3；其中S1、S2为线油，S3为块油；取材地点为吉林的样品：S4、S5、S6；其中S4、S5为线油，S6为块油；取材地点为辽宁的样品：S7、S8、S9；其中S7、S8为线油，S9为块油；中国药品生物制品检定所的标准对照哈蟆油药材：SB，为粉末。2.加入360μl缓冲液ATL和40μl蛋白酶K(20mg/mL)裂解样品，使用涡旋混合仪混匀30秒左右，56℃孵育至溶液澄清(通常1个小时可裂解完全)，每小时颠倒混合样品2～3次，或者使用水浴振荡器。其中缓冲液ATL为1％～2.5％的十二烷基磺酸钠、10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。3.可选地，加入4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋混匀，室温放置2～5min，以除去RNA。4.加入400μl缓冲液AL，涡旋混匀30sec。其中缓冲液AL为10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。5.加入700μl酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温下以最高速度离心5min6.小心将上清液转移至一新的离心管，加入700μl氯仿/异戊醇(24:1)，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温下以最高速度离心5min7.加入等体积无水乙醇，在涡旋混合器上剧烈振荡混匀30sec，室温下静置2～5min。8.将上一步所得溶液加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心1min，丢弃废液和收集管。9.将吸附柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液AW1，14000rpm离心1min，丢掉废液和收集管。其中，缓冲液AW1含36％～50％盐酸胍和20％～50％异丙醇。10.将吸附柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液AW2，14000rpm离心3min，丢掉废液和收集管。其中，缓冲液AW2含0.1％～1％叠氮钠和20％～50％异丙醇。11.将吸附柱放入1.5ml离心管，向吸附柱中加入50μlTE或者ddH2O室温下放置1min，8000rpm离心1min，获得提取的DNA。提取获得的DNA的浓度(OD值)及纯度(OD260/280)如表1所示：表1高纯度哈蟆油样品提出的DNA的浓度及纯度样本号称样量(mg)OD值OD260/280S15.258.21.79S25.454.61.71S35.178.21.77S45.7111.41.75S55.7120.41.69S65.6134.71.84S74.6102.71.88S84.9236.21.94S95.22181.91SB5.4205.41.93由此可见，利用上述方法及相关试剂抽提获得的DNA，具有较高浓度及纯度，非常适合用于进行进一步的实验或分析研究。实施例3哈蟆油高纯度基因组DNA提取试剂盒该试剂盒包括以下成分：1.吸附柱/收集管；2.缓冲液FB：含0.1％～2％盐酸的水3.缓冲液ATL：1％～2.5％十二烷基磺酸钠，10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠；4.缓冲液AL：10～20mM甘氨酸和10mM乙二胺四乙酸钠。5.缓冲液AW1：36％～50％盐酸胍和20％～50％异丙醇；6.缓冲液AW2：0.1％～1％叠氮钠和20％～50％异丙醇7.缓冲液TE8.蛋白酶K：20mg/mL9.研磨杵实施例4采用实施例2中提取的哈蟆油基因组DNA进行PCR扩增检测。配制PCR体系，其中模版为实施例2中提取获得DNA。运行PCR扩增程序。PCR产物进行DNA电泳检测，结果如图1所示，提取的所有样品都扩增出了条带，并且条带明亮，说明抽提获得的DNA适用于进行后续的PCR扩增，为进一步地研究提供了基础。当前第1页1 2 3