一种真核细胞核酸提取方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种真核细胞核酸提取方法。

背景技术：

自PCR技术在上世纪八十年代问世以来，其在分子生物学相关领域的应用越来越广泛。尤其是近年来，随着人们对临床诊断的灵敏度和特异性要求的提高，以及精准医疗概念的提出和推广，PCR技术凭借其在临床诊断中快速、敏感、特异等优点，已经迅速广泛的应用到了临床诊疗，通过检测患者样本中的基因，从而帮助医生诊断疾病、指导临床用药。另外，PCR技术也已普遍应用于司法鉴定和农业育种等领域，它已成为多个产业发展的一种基础技术。

而样本的核酸提取是PCR技术应用的前提。核酸提取方法的研究存在6个发展趋势，分别是：用非有机试剂替代传统的有机试剂提取，减少环境污染；用更加少的操作步骤替代繁琐的离心和移液等步骤，减少操作和出错风险；实现更高的核酸回收效率，更加适用于微量样本的核酸提取；便于批量操作，易于实现自动化；所用仪器、试剂和耗材的成本更低；适用的样本类型和下游的核酸检测方法更多。

核酸提取常用方法有：酚-氯仿抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、柱提法、磁珠法和Chelex-100法等。相比于其它方法，Chelex-100法具有适用样本类型多，操作相对简单，样本量要求低等，目前已在司法鉴定、微生物鉴定、基因分型等多个领域广泛应用。Chelex-100是一种螯合树脂，通过螯合细胞裂解后释放的镁离子抑制DNA酶的活性，从而有效减少DNA的降解，达到较高质量核酸提取的目的。由于Chelex-100树脂不溶于水，因此不容易均匀的加入到核酸提取容器中，对实验操作要求非常高；并且，目前所用的Chelex-100法操作步骤多，耗时长，不适合大批样本的快速核酸提取。

随着PCR技术的不断成熟，所用到DNA聚合酶的保真度越来越高，杂质的存在对于PCR反应的干扰显著降低；同时，对于DNA浓度的要求降低，PCR酶的灵敏度更高，扩增速度更快，扩增效率更好。因此，PCR技术对于核酸的要求更加小，这也允许核酸提取方法进行更多的简化和改进。

技术实现要素：

本发明要解决目前DNA提取方法中存在的抽提步骤繁琐，操作难度大，耗时长、所需试剂较多以及成本较高，大批量抽提适用性差，抽提方法适用的样本种类较少等问题。

本发明的一个目的是提供一种真核细胞核酸提取方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将待测样本和碱性液体混合，得到混合后的溶液；

2)将所述混合后的溶液在高温条件下反应，得到核酸，实现真核细胞核酸提取。

上述方法中，所述碱性液体为pH值为8-13的DEB溶液；

所述DEB溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；上述方法中，所述DEB溶液的浓度为1μmol/L-0.1mol/L。

上述方法中，所述高温为80-100℃。

上述方法中，所述反应的时间为1min-50min；

上述方法中所述反应的时间为10min。

上述方法中，所述核酸为DNA和/或RNA。

上述方法中，所述待测样本为全血、干血片、唾液、口腔拭子、细胞保存液、发根、血斑或精斑。

本发明的另一个目的是提供一种真核细胞核酸提取试剂盒。

本发明提供的一种核酸提取试剂盒，所述试剂盒的试剂为上述碱性液体。

上述试剂盒中，所述碱性液体为pH值为8-13的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；或者所述碱性液体为1μmol/L-0.1mol/L的氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

上述的核酸提取方法所得核酸在PCR扩增中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的实验证明，本发明与现有的DNA提取方法相比，省去了多次清洗、温浴和离心等操作步骤，通过在样本周围创造一种碱性高温的液体环境，加速真核细胞膜破裂和蛋白质变性，能够使真核基因组DNA的提取效率大大提升，实现了快速的DNA提取，且提取后的核酸可直接进行PCR扩增，便于自动化核酸提取和少量样本的核酸提取及其后续实验；省去了Chelex-100试剂和其它有机试剂，降低了实验操作的难度和复杂度，减少了环境污染；克服了真核细胞基因组DNA提取中的难题，实现多种样本类型的快速核酸提取；极大程度的降低了DNA抽提的时间成本和试剂成本。是一种快捷、廉价、高效的DNA抽提方式。适用于干血片、全血、唾液、口腔拭子、FTA卡、细胞保存液、发根、血斑、精斑等多种样本类型。同时，本方法在样本类型及实验室条件方面无特殊要求，是一种适用面广，适合普遍推广应用的核酸提取方法。

附图说明

图1为DNA抽提操作对比。

附图1是以全血抽提为例，通过对比两种方法抽提所需步骤数及所需时间(×10min)，其中Chelex-100抽提法获取DNA需要9步，本专利中所涉及的新方法需要3步,抽提方法更简单。另外，抽提时间方面，Chelex-100抽提法获取DNA需要80min，本专利中所涉及的新方法需要12min.，抽提时间显著压缩。

图2为PCR产物进行凝胶电泳的对比结果。

附图2中所示电泳结果是分别采用Chelex-100法和本专利中所涉及的新方法抽提全血、毛根、唾液、干血片、口腔拭子、细胞保存液等样本，经PCR扩增后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增片段大小为1116bp。结果显示新方法抽提的DNA在PCR应用中达到了与Chelex-100法相同的效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、核酸提取方法的建立

1、提取溶液配置

提取溶液为DEB(DNA extraction buffer)溶液；

DEB溶液为碱性水溶液，溶剂是双蒸水，溶质是碱性化学试剂(如氢氧化钠或氢氧化钾)，配置方法为：取一定量双蒸水，加入氢氧化钠或氢氧化钾粉末，不断搅拌至溶解，测定pH值，pH值为8-13，优选为10。

2、提取

以96孔板批量抽提为例，具体操作步骤如下：

1)将待提取样本分别加入96孔板中；

2)向1)中加入一定量(如120μL)的DEB(DNA extraction buffer)溶液(pH在8-13之间的水溶液)，用8联管或膜将96孔板密封好；

3)100℃煮沸10min，冷却后，得到核酸。

上述方法得到的核酸可作为DNA模板进行后续的PCR反应；本发明的方法取样后操作需要3个步骤，时间需要12min即可。

实施例2、全血中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组：按照实施例1中的提取液和方法进行提取：

1)将充分混匀的2μL人离体静脉全血加到96孔板中；

2)向1)中加入120μL的DEB溶液(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10)，全血和DEB的体积比为1/60，用膜将96孔板密封好；

3)100℃沸水浴10min；冷却后，得到DEB提取核酸。

对照组：Chelex-100抽提法

1)取10μL全血加到1.5mL离心管中；

2)加人500μL纯水，剧烈振荡，室温下放置15min；

3)13,000rpm离心3min，去上清；

4)重复上述两个步骤1次，尽可能地减少血红素；

5)沉淀中加入200μL 5％Chelex-100溶液(5％Chelex-100为悬浊液，使用前要充分振摇，使Chelex-100颗粒悬浮)，在振荡器上反复振荡30s；

6)放入56℃温浴30min以上；

7)取出后振荡，100℃保温10min；

8)振荡后，13,000rpm离心3min，收集上清液得到Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

比对上述实验组和对照组的提取方法的抽提所需步骤数及所需时间(×10min)(图1)：

Chelex-100抽提法获取DNA需要9步，本发明方法需要3步,抽提方法更简单；

Chelex-100抽提法获取DNA需要80min，本发明方法需要12min，抽提时间显著压缩。

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例全血样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

表1、DNA浓度检测结果

3、核酸的PCR验证

选择针对人的GAPDH基因的引物进行目的片段的扩增。所用引物采用Primer Blast自行设计，由华大基因(BGI)合成。

引物序列分别见序列1和序列2，具体序列如下。

序列1：5’-TCCAAAATCAAGTGGGGCGAT-3’(GAPDH-F)

序列2：5’-GCCAGACCCTGCACTTTTTAAG-3’(GAPDH-R)

PCR反应体系：上述一的两种方法分别提取的核酸2μL，10×Buffer(无Mg²⁺)2.5μL,2.5Mm dNTP 2μL,25mM MgCl₂ 1.5μL,引物混合液10mM 0.5μL,高保真Taq酶0.5μL,ddH₂O补齐剩余体积。

PCR扩增过程：94℃3min,(94℃15s,60℃60s，72℃1min)×35cycles 72℃3min,4℃∞。

采用琼脂糖凝胶电泳。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例3、干血片中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组：

1)用取直径为3mm的新生儿足跟血干血片(打孔获得)加入到96孔板中；

2)与实施例2的实验组的2)相同，(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10，)；

3)实施例2的实验组的3)相同，得到碱性DEB提取核酸。

对照组：

1)取直径为3mm的干血片，加到1.5mL的离心管中；

2)-8)同实施例2的对照组的2)-8)，得到Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

与实施例2相同；

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例干血片样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

3、核酸的PCR验证

方法与实施例2相同。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例4、唾液中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组：

1)取10μL混匀的人的唾液加到96孔板中；

2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10)；

3)实施例2的实验组的3)相同，得到碱性DEB提取核酸。

对照组：

1)取10μL唾液加到1.5mL离心管；

2)-8)同实施例2的对照组的2)-8)，得到Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

与实施例2相同；

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例唾液样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

3、核酸的PCR验证

方法与实施例2相同。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例5、口腔拭子中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组：

1)将采集人口腔上皮细胞的口腔拭子置于含500μL的DEB溶液(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10))的1.5mL离心管中震荡1min，得到液体；

2)取10μL上述液体于96孔板中；

3)100℃沸水浴10min；冷却后，得到碱性DEB提取核酸。

对照组：

1)将口腔拭子加入到含500μL纯水的2mL离心管中；

2)-8)同实施例2的对照组的2)-8)，得到Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

与实施例2相同；

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例口腔拭子样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

3、核酸的PCR验证

方法与实施例2相同。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例6、细胞保存液中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组

1)取150μL人宫颈上皮脱落细胞保存液(保存液配方来源见专利CN101999343B)加入96孔板中，4000rpm,离心10min，去上清；

2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10)；

3)与实施例2的实验组的3)相同，得到碱性DEB提取核酸。

对照组：

1)取500μL细胞保存液与于1mL离心管中；

2)2)-8)同实施例2的对照组的2)-8)，得到Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

与实施例2相同；

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例宫颈脱落细胞保存液样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

3、核酸的PCR验证

方法与实施例2相同。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例7、发根中核酸提取

一、本发明的方法与Chelex-100抽提法

实验组：

1)用镊子夹住毛发的根部，剪去其余部分，将毛根放入96孔板中；

(注：处理毛发时很容易遗失，应小心操作，最好在桌面上铺一张白纸。加人纯水洗一次)；

2)与实施例2的实验组的2)相同(浓度为0.004g/L的氢氧化钠水溶液；pH值10)；

3)实施例2的实验组的3)相同，得到碱性DEB提取核酸。

对照组：

用镊子夹住毛发的根部，剪去其余部分，将毛根放入0.5mL离心管中(处理毛发时很容易遗失，应小心操作，最好在桌面上铺一张白纸。)，加人纯水洗一次，然后加入30μL 5％的Chelex-100和2μL 5mg/mL的PK酶，放入56℃保温6小时以上。取出振荡，100℃保温8min，振荡，13000rpm离心3min，上清即为Chelex-100抽提核酸。

二、两种方法提取核酸的比较

1、抽提所需步骤数及所需时间

与实施例2相同；

2、核酸提取效率

采用Thermo公司的NanoDrop 8000分光光度计检测两种方法提取的8例发根样本DNA浓度，结果显示新方法提取的DNA浓度显著高于Chelex-100法。见表1所示。

3、核酸的PCR验证

方法与实施例2相同。

结果如图2所示，新方法获取的DNA进行PCR后电泳条带与Chelex-100法一致，说明新方法提取的DNA完全适用于PCR反应。

实施例8、一种试剂盒及其应用

试剂盒的试剂组成：1μmol/L-0.1mol/L的氢氧化钠水溶液或1μmol/L-0.1mol/L氢氧化钾水溶液。

本试剂盒可用于上述实施例中核酸样本的提取，但不局限用于上述实施例中样本种类核酸的提取。

序列表

<110>深圳华大基因股份有限公司

<120>一种真核细胞核酸提取方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

tccaaaatca agtggggcga t 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gccagaccct gcacttttta ag 22