一种裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及了一种裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法。

背景技术：

裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）主要用途：是提取DHA（二十二碳六烯酸），其下脚料藻粕中不但含有微量残余DHA，磷脂，而且含有丰富的蛋白质，多肽，寡肽，氨基酸以及多糖类等，是一种食品源的医药提取原材料，已经被证实其五毒无害无副作用。 其中DHA是二十二碳六烯酸，俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，属于Omega-3 不饱和脂肪酸家族中的重要成员。从榨油下脚料藻粕中通过蛋白酶酶解的方法获取医药用物质，是把废物变成宝贝，是一项卓越的资源再利用，不但有重要的医药用途，而且还对环境起到一定的保护作用。藻粕经过粉碎，酶解分离，干燥后得到的活性肽，具有显著地抑菌、抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫力的功效，是一种重要的药物原材料或食品添加剂，具有显著的社会和经济效益。

技术实现要素：

本发明提供一种裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法。运用裂殖壶菌藻粕为原料，在实验室研究基础上，运用到车间中，进行中试生产所设计的制备方法，为今后再进行大规模生产奠定基础。本发明，采用较廉价的原材料，运用高效的方法--生物酶解的方法，制备具有显著地抑菌、抗病毒、抗肿瘤、调节机体免疫力的生物活性肽，设计出相对应的中试生产工艺方法。为后期活性肽在食品添加剂，药物辅料中的推广及大规模的生产做好准备。

为实现此目的，本发明采用如下技术方案：

源于裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法，以裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸（DHA)的裂殖壶菌藻粕为原材料，先将微藻粕粉碎成粉末，加入磷酸盐缓冲液，然后加入食品级蛋白酶酶解，离心过滤，超滤，得滤液，喷雾干燥得到生物活性肽。

源于裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法，其具体制备步骤如下：

1)把裂殖壶菌藻粕粉碎至粉末无颗粒状过120目筛网；

2)添加磷酸盐缓冲液为PBS，pH值为7.2-7.4，其中裂殖壶菌藻粕粉末的重量是PBS的体积的8%-12%；

3)加入蛋白酶是胰蛋白酶和胃蛋白酶即酶切位点包括赖氨酸与精氨酸的酶类，此双酶协同作用，按照1:1的比例加入到上述的裂殖壶菌藻粕混合液中，其总加入质量是裂殖壶菌藻粕粉末质量的3%-5%；

4)酶解条件是：36-38℃，转速为30r/min-80r/min，酶解时间为6-8小时；

5)酶解液离心过滤，取上清液， 上清液经过活性炭处理装置除去腥味，过超滤设备即得1000Da以下的过滤液，再经过喷雾干燥机干燥，获得生物活性肽粉末。

本发明的显著优点是：本发明所涉及一种源于裂殖壶菌藻粕蛋白酶解肽的制备方法，显著特点归结如下：

1）裂殖壶菌藻粕是生产DHA后的废料，一种变废为宝做法；

2）在过滤液干燥的部分采用喷雾干燥代替了传统的冷冻干燥的方法，很大程度上提高了干燥效率，便于生物活性肽的扩大生产；

3）该活性肽具有显著地抑菌、抗炎症、等功能，是一种绿色的药物辅料，食品添加剂，具有显著的社会和经济效益。

附图说明

图1是生产工艺流程图。

图2是对比分析裂殖壶菌藻粕酶解前和酶解后的质谱扫描图，综合峰面积数据，绘制每种肽含量的比例柱状图（新的32个分子量即裂殖壶菌藻粕蛋白酶酶解肽）。

图3、图4、图5、图6是裂殖壶菌藻粕溶解液通过Q-TOF-MS/MS所得的质谱扫描图（300-850 Da）。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

将裂殖壶菌藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕粉碎，过120目筛网。称取粉碎藻粕10.0g，胰蛋白酶0.30mg，胃蛋白酶0.30mg，配置磷酸缓冲溶液100mL于锥形瓶中，在摇床里进行酶解.摇床温度设定为37度，搅拌转速为80r/min,酶解时间6小时。酶解液离心取滤液，离心机的转速设定为4000 rpm，离心时间为10min。加入3%滤液体积的活性粉末，搅拌均匀后静止2小时，再离心取滤液，离心机的转速设定为4000 rpm，离心时间为10min。滤液过超滤设备，超滤设备的膜大小选择1000Da。将过超滤设备的滤液，通过冷冻干燥机干燥，即刻获得海藻肽粉末，该海藻肽粉末的收率大概在40%左右，其中32种新酶解肽含量比例如图2所示。

实施例2

将裂殖壶菌藻DHA（二十二碳六烯酸）油下脚藻粕粉碎，过120目筛网。称取粉碎藻粕10.0kg，胰蛋白酶0.30kg，胃蛋白酶0.30kg，配置磷酸缓冲溶液100L，并将它们一起加入酶解罐中酶解.其中酶解温度设定为37度，搅拌转速为50r/min,酶解时间6小时。酶解液过离心机得澄清过滤液，离心机的转速设定为4000 rpm，将过滤液通过活性炭处理设备除去腥味，再通过超滤设备，超滤设备的膜大小选择1000Da。将通过超滤设备的滤液，经过喷雾干燥机干燥，即刻获得海藻肽粉末，该海藻肽粉末的收率大概在35%左右。，其中喷雾干燥的喷头出口的温度设定为温度为200度，喷头转速为20000r/min。

实施例3

取10g藻粕粉、100ml PBS溶于250ml的锥形瓶中，不加酶，进行摇床10min，摇床温度设定为37度，搅拌转速为80r/min,离心取滤液，离心机的转速设定为4000 rpm，离心时间为10min。加入3%滤液体积的活性粉末，搅拌均匀后静止2小时，再离心取滤液，离心机的转速设定为4000 rpm，离心时间为10min。滤液过超滤设备，超滤设备的膜大小选择1000Da。将过超滤设备的滤液，通过冷冻干燥机干燥，即刻获得溶解的藻粕粉末。将实施例1海藻肽粉末和藻粕粉末，通过Q-TOF-MS/MS，即藻粕酶解前与酶解产物进行成分对比，质谱扫描结果如（图3、图4、图5、图6）所示。经过数据结果的对比，共在酶解产物中找到32个新的分子量，已在分子量下方用红色短竖线标出。综合峰面积数据，绘制每种肽含量的比例柱状图（如图2所示），以便于确定有效成分。样品成分主要集中300-850 Da之间（图3、图4、图5、图6）中分两个区间予以显示。藻粕粉末经酶解后产物中多出的32个不同分子量的成分均集中在该区域，各种生物活性便来源于这32个分子量对应的小肽，即裂殖壶菌藻粕蛋白酶酶解肽。