紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法与流程

本发明涉及海洋活性物质生物制品生产技术领域，尤其涉及一种紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法。

背景技术：

糖尿病是一种由多因素作用引发的高血糖代谢疾病，其发病机制主要为胰岛素抵抗、氧化应激作用、β细胞功能受损、细胞因子炎症。目前治疗糖尿病的作用机理主要是改善胰岛素的分泌与抵抗，维持胰岛β细胞含量稳定。此外，糖分解过程中各种酶抑制剂的使用也是糖尿病的一种治疗方法。由于酶解法制备天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂条件可控，反应条件温和，产物具有较强的抑制活性和很强的安全性而使其受到人们的广泛关注。

锌、铁等金属元素作为人体必须的微量元素之一，对人体至关重要。锌的生物功能繁多，包括参与葡萄糖和脂质代谢，细胞增殖、免疫神经系统和胰岛素的合成等。铁存在于人体的所有细胞中，参与蛋白质的组成、构成线粒体呼吸链的重要成分、是许多酶的组成成分。人体对食物中的铁、锌等金属元素利用率很低，因此，寻找一种安全、有效的营养补充剂产品，对人体健康有着重要意义。

多肽-金属螯合物作为一种有机金属化合物，更接近于机体内金属元素的作用形式，能够达到更好的营养补充效果。并且多肽-金属螯合物可以通过多肽形式转运吸收，避免与氨基酸之间的竞争，提高金属元素的利用率，发挥更多的生理作用。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法，本发明公开了一种新型天然原料酶解活性肽，其既具备靶酶的抑制活性，又能够螯合微量金属元素，所制备的活性肽金属螯合物能够被人体快速吸收，从而起到补充铁锌和治疗糖尿病的作用。

本发明的一种紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法，包括以下步骤：

(1)将粉碎的紫菜与蛋白酶在缓冲溶液中发生酶解反应，酶解结束后，离心并取上清液；

(2)过滤步骤(1)得到的上清液，浓缩并干燥滤液，得到固体多肽粉；

(3)将步骤(2)得到的固体多肽粉溶于金属盐水溶液，发生螯合反应，得到紫菜酶解活性肽金属螯合物。

进一步地，在步骤(1)中，蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和氨肽酶。

进一步地，碱性蛋白酶为国产商品酶地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶。中性蛋白酶为国产商品酶枯草芽孢杆菌蛋白酶。氨肽酶为发明人在专利CN104293749A中公开的枯草芽孢杆菌亮氨酸氨肽酶。

进一步地，在步骤(1)中，碱性蛋白酶的含量为7×10⁴-9×10⁴U.g^-1紫菜，中性蛋白酶的含量为7×10⁴-9×10⁴U.g^-1紫菜，氨肽酶的含量为25-30U.g^-1紫菜。

进一步地，在步骤(1)中，酶解反应的温度为45-55℃，酶解时间为5.5-6.5h。

进一步地，在步骤(1)中，缓冲溶液的pH为8.0-9.0，在此pH下，所制备的产物对α-葡萄糖苷酶抑制率最高。

进一步地，在步骤(1)中，缓冲溶液的浓度为20-200mmol/L。

进一步地，在步骤(1)中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

进一步地，在步骤(1)中，紫菜与缓冲溶液的质量体积比为1:30-1:35g/ml。

进一步地，在步骤(1)中，紫菜为条斑紫菜或坛紫菜。

进一步地，在步骤(1)中，将紫菜在40-60℃下干燥后粉碎、过40-80目筛，得到粉碎的紫菜。

进一步地，在步骤(2)中，依次使用截留分子量为10kDa-30kDa的超滤膜和500Da-1kDa的纳滤膜进行过滤，这样可以得到纯度更高的活性肽，该活性肽具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制性。

进一步地，在步骤(2)中，对上清液稀释1.4-1.8倍后进行过滤。

进一步地，在步骤(2)中，浓缩液浓度为1mg/ml时对0.5mg/mlα-葡萄糖苷酶(2×10⁴U.g^-1)的抑制率为68％。

进一步地，在步骤(2)中，采用空气喷雾干燥或冷冻干燥方式进行干燥。

进一步地，在步骤(2)中，固体多肽粉的产率为45-55％。

进一步地，在步骤(2)中，固体多肽粉为双功能活性肽，其既有α-葡萄糖苷酶抑制活性又具有螯合金属元素的功能。

进一步地，在步骤(3)中，金属盐为氯化锌、硝酸锌、氯化亚铁或氯化钙。

进一步地，在步骤(3)中，螯合反应的pH为4.0-5.0，温度为35-40℃，反应时间为1.5h-2h。

进一步地，在步骤(3)中，固体多肽粉与金属盐的质量比为6:1-24:1。

进一步地，在步骤(3)中，固体多肽粉的浓度为2-6mg.mL^-1。

进一步地，在步骤(3)中，为了避免造成微量元素补充过度，金属盐水溶液的浓度优选为大约0.5mmol/L。

进一步地，在步骤(3)中，紫菜酶解活性肽金属螯合物的螯合度为25-30％，控制(螯合物中)多肽浓度为1mg/ml时对0.5mg/mlα-葡萄糖苷酶的抑制率达79-83％。

本发明还请求保护上述紫菜酶解活性肽金属螯合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，α-葡萄糖苷酶抑制剂可应用于食品、医药、保健品领域。

本发明将紫菜在特定条件下酶解，经过离心、膜过滤等分级提取后制备出活性肽，然后将该活性肽与一些特定的金属离子发生螯合反应，其多肽链构象会发生一定的改变，上述金属离子包括某些本身对α-葡萄糖苷酶就发现有一定抑制性作用的金属元素，如锌，或者是本身对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用的金属离子，多肽链构象改变后使得螯合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用有一定增效的作用，因此本发明制备的紫菜酶解活性肽金属螯合物对α-葡萄糖苷酶抑制率提高。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

我国拥有丰富的海洋资源，本发明利用现代生物技术对紫菜蛋白进行组合可控酶解获得酶解液，与金属盐螯合工艺简单，产品安全；酶解时使用三种蛋白酶，通过对酶解条件的优化，制备了具有糖苷酶抑制活性的固体多肽粉，其产率为45-55％。本发明制备多肽与金属离子螯合后，多肽的构象发生改变，使得紫菜酶解活性肽金属螯合物的糖苷酶抑制活性提高；经过与金属螯合后糖苷酶抑制活性比未螯合的多肽液提高了15％以上，且具有良好的胃肠稳定性，所得的紫菜酶解活性肽金属螯合物有药食两用的保健治疗作用，对未来医药保健与食品的健康发展具有推动与促进作用。

附图说明

图1是本发明紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法流程图；

图2是不同浓度的Zn与α-葡萄糖苷酶抑制率的关系图；

图3图示了本发明紫菜酶解活性肽金属螯合物在胃消化阶段对胃蛋白酶的时间、质量稳定性的结果；

图4图示了本发明紫菜酶解活性肽金属螯合物在十二指肠消化阶段对胰蛋白酶的时间、质量稳定性的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

(1)α-葡萄糖苷酶抑制率的测定方法如下：

采用PNPG(4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷)法，取一份待测样品与一份0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶混合均匀，37℃水浴保温10min，再加入一份10mmol·L^-1PNPG，反应1h后加入一份1mol·L^-1Na₂CO₃终止反应，在405nm处测定吸光度Αi。取一份待测样品与一份0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶混合均匀，37℃水浴保温10min，加入一份金属盐溶液反应1h，然后加入一份1mol·L^-1Na₂CO₃终止反应，在405nm处测定吸光度Αj。取一份金属盐溶液加入离心管中，然后加入一份1mol·L^-1Na₂CO₃，在405nm处测定吸光度Α₀，通过以下公式计算样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率：

抑制率＝[1-(Ai-Aj)/A₀]×100％

(2)螯合率的测定方法如下：

采用火焰原子吸收分光光度计测定待测样品螯合前后金属的总量分别为A1、A2，螯合度计算公式为：螯合度＝A2/A1。

实施例1紫菜α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的酶解与制备

以条斑紫菜为原料，烘干、粉碎，过筛，取40目的紫菜蛋白干粉加入到20mmol/L、pH8.5的NaHCO₃-NaH₂CO₃缓冲液中，紫菜蛋白干粉的质量与缓冲液的体积比例为1:33g/mL。再加入碱性蛋白酶E/S＝8×10⁴U/g，中性蛋白酶8×10⁴U/g干基质，氨肽酶28U/g，在50℃下酶解6h。碱性蛋白酶购自庞博公司，中性蛋白酶购自苏柯汉公司，其型号为SUKAPro NE，氨肽酶由发明人自主研发制备，制备方法见专利CN104293749A。沸水浴灭酶，离心取上清液。将上清液稀释1.6倍后通过滤膜分别为10kDa的超滤膜和1kDa的纳滤膜，收集透过液，然后将其经旋转蒸发仪50℃浓缩，真空冷冻干燥后收集冻干粉，即为紫菜α-葡萄糖苷酶抑制活性肽。

配制1mg/ml的冻干粉的水溶液，测得其α-葡萄糖苷酶抑制率为68％。

实施例2单独ZnCl₂溶液对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

分别配制浓度为0.1-0.5mmol/L的ZnCl₂溶液，测定不同浓度金属溶液对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响，如图2所示，随着ZnCl₂溶液浓度的增大，对α-葡萄糖苷酶抑制率逐渐增大，说明单独的ZnCl₂溶液对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。

实施例3紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽锌螯合物的制备

将0.18g紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽溶于30mL浓度为0.5mmol/L的ZnCl₂溶液，使溶液中紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的浓度为6mg/ml。调节溶液pH至4.5，然后置于37℃的振荡水浴摇床中反应1.5h，得到紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽锌螯合物。测得其螯合度为25.6％。将产物配成1mg/ml浓度的溶液，按上述说明书中方法测定其α-葡萄糖苷酶抑制率，结果为79.8％。

实施例4紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽铁螯合物的制备

将0.09g紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽溶于30mL浓度为0.5mmol/L的FeCl₂溶液，使溶液中紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽的浓度为3mg.mL^-1。调节溶液pH至5，然后置于60℃的振荡水浴摇床中反应2h，得到紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽铁螯合物。测得螯合多肽的螯合度为29.8％，将产物配成1mg.mL^-1浓度的溶液，按上述说明书中方法测定其α-葡萄糖苷酶抑制率，结果为82.78％。

实施例5体外模拟胃肠稳定性

胃肠消化分为胃消化和十二指肠消化两个阶段。按照下述方法在体外模拟本发明制备的紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽锌螯合物的胃肠稳定性：

胃消化阶段：定量配制1mg.mL^-1的螯合多肽溶液，并将pH调到2.0(1M的HCl)。37℃恒温孵育15min，加入不同质量的胃蛋白酶，37℃恒温震荡一定时间，将pH调至7.0(5M的NaOH)，终止胃蛋白酶反应。十二指肠消化阶段：将经过胃消化阶段的螯合多肽溶液置于37℃恒温孵育15min，按照α-葡萄糖苷酶抑制肽-Zn螯合物与酶不同质量比加入胰蛋白酶，继续37℃恒温震荡一定时间。置于85℃恒温保温20min，终止十二指肠消化反应。分别测定胃消化阶段和十二指肠消化阶段α-葡萄糖苷酶抑制活性。图3-4分别为该产物在胃消化阶段和十二指肠消化阶段的时间、质量稳定性，从图中可以看出，在消化时间内，产物的α-葡萄糖苷酶抑制率基本没有发生变化，结果表明：紫菜酶解产物α-葡萄糖苷酶抑制活性多肽锌螯合物具有良好的胃肠稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。