特异性顺式作用元件及含该顺式作用元件的启动子和核酸构建体及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及几丁质特异诱导表达启动子Ptchi2和特异性顺式作用元件及其应用。

背景技术：

基因表达调控是基因工程研究的中心内容之一，转录水平的调控发生在基因表达的初期，是基因表达调控的主要方式，启动子则是基因转录水平表达调控的重要和关键元件，在基因的调控方面起着决定性作用。诱导型启动子灵活的表达调控方式赋予了生物更强的适应环境变化能力和广阔的开发利用前景。利用诱导型启动子代替组成型启动子，已成为实现基因表达调控的一个重要策略，并应用于酵母的外源基因表达调控、植物抗逆和抗病虫基因工程领域。如典型的巴斯德毕赤酵母表达系统，利用的是醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子，诱导物为甲醇，目前已广泛应用于异源蛋白的表达调控，但是甲醇有毒易燃，应用受到一定的限制；hsr203J为来源于烟草的病原诱导型启动子，转基因烟草中由hsr203J驱动的popA基因提供了对卵菌病原体的高度抗性，拟南芥逆境胁迫诱导表达基因rd29A启动子在转基因小麦中可以调控小麦的耐旱、耐寒性等等。除了直接利用全长启动子驱动基因的表达外，利用已知的诱导顺式调控元件组合进行基因表达调控已成为一个重要策略，具有良好的应用前景。

一个理想的诱导表达启动子应具有高效诱导性、特异性和诱导物的安全性，但是目前比较理想、能应用于实际生产的诱导型启动子还很少。几丁质作为几丁质诱导启动子的诱导物，不仅安全、经济，而且也是主要植物病原真菌细胞壁的重要成分，在基因表达调控和诱导植物抗病性方面发挥重要作用，具有重要的研究应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了启动子Ptchi2的全序列、核心序列、响应几丁质诱导的顺式作用元件及其应用，启动子Ptchi2为内切几丁质酶基因Tachi2的启动子，是从棘孢木霉TD3104(保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.13161)中克隆得到的，该启动子为诱导型启动子，具有被几丁质特异诱导、不受葡萄糖抑制的独特诱导启动特性。

本发明的技术方案为：

一种启动子，所述启动子含有选自以下任一组并具有启动子功能的核苷酸序列；

a、SEQ ID No:1所示的核苷酸序列；

b、与SEQ ID No:1互补的核苷酸序列；

c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

在本发明中，所述对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ ID NO：1的参考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指：在SEQ IDNO：1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5％。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。

在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO：1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

在本发明中，所述与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

本发明的另一方面涉及一种核酸构建体，其包含上述的启动子，与启动子可操作连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。所述核酸构建体为重组载体、重组菌或表达盒。

本发明还涉及用于扩增本发明所述启动子的引物对，所述引物对的两条引物分别为SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示的序列；优选的，所述引物对的两条引物在5’端还分别链接有限制性酶切位点和/或保护碱基；具体的，所述引物对的两条引物分别具有SEQ ID No:4和SEQ ID No:5所示的序列。

本发明还涉及一种制备SEQ ID No:1所示的启动子的方法，包括以棘孢木霉TD3104基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在棘孢木霉TD3104gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，例如为本发明上述的引物对。

本发明还涉及一种调控基因表达的方法，所述方法包括将本发明的启动子或者含有启动子序列的构建体导入植物或真菌。上述方法用于调控植物或酵母中目的基因表达或植物育种或者用于植物抗病、虫基因工程。

本发明的启动子Ptchi2的核心序列为SEQ ID No:1中第829-1042位所示的核苷酸序列；响应几丁质诱导的顺式作用元件为SEQ ID No:1中第869-877位或第880-888位所示的核苷酸序列，具体序列是5’-ACTTGTTCA-3’。启动子Ptchi2为诱导型启动子，能被几丁质特异性诱导，而不被葡萄糖抑制。

棘孢木霉TD3104是一株优良的植物病害生防菌，启动子Ptchi2是棘孢木霉TD3104内切几丁质酶基因Tachi2的启动子。本发明首次从棘孢木霉TD3104中克隆得到内切几丁质酶基因Tachi2的启动子Ptchi2，几丁质特异诱导表达启动子Ptchi2为诱导型启动子，被几丁质特异性诱导，而不受葡萄糖抑制，并且存在目前未被发现的响应几丁质新顺式作用元件和一种几丁质诱导调控基因转录的新机制。本发明提供了诱导型启动子Ptchi2全序列、核心序列、响应几丁质诱导的顺式作用元件及其应用，为基因表达调控提供了一个新的选择，对于基因表达调控研究和转基因育种都具有重要作用，有广阔的应用前景。

本发明克隆获得启动子Ptchi2全序列，并成功构建了启动子Ptchi2的植物表达载体和酵母表达载体，以EGFP和RFP为报告基因，将上述表达载体侵染洋葱表皮细胞或电转化酵母细胞，在胶体几丁质的诱导下，均能检测到报告基因的表达，且表达不受葡萄糖的抑制，因此，启动子Ptchi2在植物和酵母中均具有启动子活性，可调控基因的表达；利用缺失突变研究了启动子Ptchi2的核心序列为SEQ ID No:1中第829-1042位所示的核酸序列、响应几丁质诱导的顺式作用元件为SEQ ID No:1中第869-877位或第880-888位所示的核酸序列，具体序列是5’-ACTTGTTCA-3’，即命名为CSICAE；构建CSICAE与花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子核心序列融合的杂合启动子，验证了CSICAE为响应几丁质诱导所必需的顺式作用元件，因此，启动子Ptchi2可应用于真菌和植物基因的表达调控、植物抗病、虫基因工程中。

附图说明

图1是启动子PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为DL5000DNA Marker；1、2为PCR扩增产物；

图2是Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos表达载体酶切产物琼脂糖电泳检测结果，其中1是Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物；2是用Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切产物；M1是DL5000DNA Marker；M2是DL15000 DNA Marker；

图3是含有启动子Ptchi2重组载体的根癌农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达检测结果，其中A是在MS固体培养基中培养的EHA105-E介导的洋葱表皮细胞；B是在含1mg/mL胶体几丁质的MS固体培养基中培养的EHA105-E介导的洋葱表皮细胞；C是在MS固体培养基中培养的EHA105-R介导的洋葱表皮细胞；D是在含1mg/mL胶体几丁质的MS固体培养基中培养的EHA105-R介导的洋葱表皮细胞；

图4是pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos表达载体转化毕赤酵母GS115诱导表达检测结果，其中A，GS115-Ptchi2-EGFP在添加葡萄糖的SM培养基上培养5d；B，GS115-Ptchi2-EGFP 在添加胶体几丁质的SM培养基上培养5d；C，GS115-Ptchi2-EGFP在同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基上培养5d；

图5是pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos表达载体转化毕赤酵母GS115诱导表达检测结果，其中A，GS115-Ptchi2-RFP在添加葡萄糖的SM培养基上培养5d；B，GS115-Ptchi2-RFP在添加胶体几丁质的SM培养基上培养5d；C，GS115-Ptchi2-RFP在同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基上培养5d；

图6是含Ptchi2启动子829bp-1042bp区域重组载体的根癌农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达检测结果，其中A，在MS固体培养基中培养的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达；B，在含1mg/mL胶体几丁质的MS固体培养基中培养的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达；C，在MS固体培养基中培养的农杆菌介导的洋葱表皮细胞RFP瞬时表达；D，在含1mg/mL胶体几丁质的MS固体培养基中培养的农杆菌介导的洋葱表皮细胞RFP瞬时表达；

图7是Ptchi2核心区(829bp-1042bp)驱动荧光蛋白在酵母中的诱导表达检测结果，其中A，添加葡萄糖的SM培养基上培养5d的酵母EGFP表达检测；B，添加胶体几丁质的SM培养基上培养5d的酵母EGFP表达检测；C，同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基上培养5d的酵母EGFP表达检测；D，添加葡萄糖的SM培养基上培养5d的酵母RFP表达检测；E，添加胶体几丁质的SM培养基上培养5d的酵母RFP表达检测；F，同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基上培养5d酵母RFP表达检测；

图8是含CSICAE杂合启动子重组载体的根癌农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达检测结果，其中A，在含胶体几丁质MS固体培养基中培养的、不含CSICAE的CaMV35S启动子的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达检测；B，在含葡萄糖MS固体培养基中培养的含1个CSICAE的CaMV35S杂合启动子的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达检测；C，在含胶体几丁质MS固体培养基中培养的含1个CSICAE的CaMV35S杂合启动子的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达检测；D，在同时含胶体几丁质和葡萄糖MS固体培养基中培养的含1个CSICAE的CaMV35S杂合启动子的农杆菌介导的洋葱表皮细胞EGFP瞬时表达检测；

图9是含CSICAE杂合启动子驱动绿色荧光蛋白基因在酵母中的诱导表达检测结果，其中A，添加胶体几丁质SM培养基中培养5d的不含CSICAE、仅含CaMV35S启动子核心序列的酵母转化子EGFP表达检测；B，添加葡萄糖的SM培养基中培养5d的含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子的酵母转化子EGFP表达检测；C，同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基中培养5d的含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子的酵母转化子EGFP表达检测；D，添加胶体几丁质的SM培养基中培养5d的含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子的酵母转化子EGFP表达检测。。

具体实施方式

下述具体实施例仅用于说明本发明，但不限定本发明的范围，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

“CSICAE”是Chitin specific induction cis-acting element的缩写。

本发明涉及Ptchi2启动子及其具有相同功能特征的多核苷酸突变体。这些核苷酸突变体包括取代突变体、缺失突变体和插入突变体。如本领域所知的，突变体可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变该启动子的功能。

本发明的Ptchi2启动子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用木霉基因组DNA作为模板，扩增而得有关序列。

本发明也涉及包含本发明启动子元件的构建物或载体，以及用所述构建物或载体转化的宿主细胞(尤其是酵母和植物细胞)，以及由此再生的植株。

适用于本发明的外源基因没有特别限制，几乎所有的外源基因都可用于本发明，尤其是与代表性的外源基因的例子包括但并不限于RFP基因、GFP基因等。将这些基因与本发明的Ptchi2启动子相连，形成含外源基因的构建物。

在本发明中适用的载体包括但不限于：表达载体、克隆载体，例如适用于原核(如大肠杆菌等细菌)、真核(如酵母)、植物细胞中的载体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Ptchi2启动子和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。

实施例1、启动子的制备及几丁质特异诱导表达验证

一、启动子的制备

1、PCR扩增

以棘孢木霉Trichoderma asperellum TD3104基因组DNA为模板，用4POS和4POA引物对进行PCR扩增。

引物序列如下：

4POS：5’-AACTCGTTGATTGGGGAGGATAATAGCAG-3’ SEQ ID No:2

4POA：5’-GGTTATTGGTGATGAAAAGTAATTGGAGAT-3’ SEQ ID No:3

反应体系如下：

反应程序：95℃预变性5min；94℃变性45s；54℃退火45s；72℃延伸60s，共进行36个循环；72℃延伸10min。结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，胶回收目的产物。

将目的产物与载体pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取阳性单克隆测序，获得1128bp启动子序列。序列如SEQ ID No:1所示。

SEQ ID No:1

二、几丁质特异诱导启动子Ptchi2洋葱表皮细胞瞬时表达验证

1启动子Ptchi2全长克隆载体的构建

为了方便后续的构建载体操作，根据启动子Ptchi2全长序列，在引物的5′端设计相应的酶切位点，设计如下引物：

PS0：CGAGCTCACTAGTAACTCGTTGATTGGGGAGGATAATAGCAG SEQ ID No:4

PA0：GCTCTAGAGGTTATTGGTGATGAAAAGTTAATTGGAGAT SEQ ID No:5

以棘孢木霉Trichoderma asperellum TD3104(CGMCC No.13161)基因组DNA为模板，用引物对PS0和PA0进行PCR扩增。将目的产物与载体pMD18-T连接，连接产物转化大肠杆菌，抗性筛选培养，挑取阳性单克隆测序验证，测序正确的重组质粒记作pMD18-T-Ptchi2Vector。

2Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos植物表达载体构建

利用OMEGA质粒提取试剂盒，分别提取pMD18-T-Ptchi2Vector和Pcb302质粒，用限制性内切酶Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后回收目的条带(Ptchi2和Pcb302载体骨架)，用T4DNALigase，16℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆测序，提取质粒命名为Pcb302-Ptchi2。

将质粒pMD18-T–EGFP-Z Vector(绿色荧光蛋白EGFP基因两侧分别设计有Xba Ⅰ和Xma Ⅰ酶切位点)和Pcb302-Ptchi2用Xba Ⅰ和Xma Ⅰ进行双酶切，胶回收约750bp的EGFP和Pcb302-Ptchi2载体片段，连接后获得质粒命名为Pcb302-Ptchi2-EGFP。

质粒Pcb302-Ptchi2-EGFP和pMD18-T-Tnos Vector(胭脂碱合成酶基因终止子Tnos序列两侧分别设计有Xma Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点)用Xma Ⅰ和EcoR Ⅰ进行双酶切，胶回收约300bp的Tnos和Pcb302-Ptchi2-EGFP载体片段，连接后转化大肠杆菌，筛选阳性克隆以获得植物表达载体，经PCR验证、酶切验证(图2)并测序，正确质粒命名为Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos。

3Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos植物表达载体构建

提取pMD18-T-RFP-Z Vector(RFP基因两侧分别设计有Xba Ⅰ和Xma Ⅰ酶切位点)和Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos质粒，用Xba Ⅰ和Xma Ⅰ进行双酶切，胶回收RFP目的基因和载体，用T4DNA Ligase，16℃连接过夜，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行PCR验证和酶切验证。连接后获得植物表达载体，质粒命名为Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos。

4表达载体Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos和Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos转化农杆菌

将Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos和Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos分别转化冻融法制备的农杆菌EHA105感受态细胞。获得Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos的农杆菌EHA105转化子EHA105-E，Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos的农杆菌EHA105转化子EHA105-R。

5洋葱表皮细胞瞬时表达体系检测Ptchi2启动活性

胶体几丁质的制备：称取10g几丁质粉缓慢加入100mL浓盐酸中，搅拌至几丁质完全溶解，加入5倍体积预冷的50％乙醇，4000rpm离心20min，沉淀用蒸馏水冲洗至中性，调节浓度至25mg/mL，备用。

去掉新鲜的洋葱外层2-3层鳞片，取内表面的表皮贴于MS培养基上，25℃培养箱中暗培养过夜。

分别将农杆菌EHA105-R、EHA105-E 10μL菌液接种于10mL含有Kan 50mg/L和Rif 50mg/L的YEB液体培养基中，200r/min、28℃培养至OD₆₀₀值为0.6左右。4℃、2800g、10min离心；菌体用约25mL MS液体培养基重悬菌体(MS液体培养基中乙酰丁香酮终浓度为20μmol/L、氯化镁终浓度为10mmol/L)。

将黑暗培养的洋葱表皮放于MS重悬的菌液中，用镊子将洋葱表皮浸在菌液中与菌液充分接触。侵染20min后洋葱表皮用灭菌滤纸将菌液吸干，分别铺于新的含1mg/mL胶体几丁质的MS固体培养基及同时含有1mg/mL胶体几丁质和葡萄糖的MS固体培养基中继续诱导培养，对照组用不含有胶体几丁质的MS固体培养基、含有1mg/mL葡萄糖的MS固体培养基，3次重复。25℃培养箱中培养16h后，利用Nikon eclipse Ti荧光倒置显微镜进行荧光显微镜观察。

结果如图3所示，含有启动子Ptchi2重组载体的根癌农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达时，在几丁质诱导后呈现相应的绿色或红色荧光(图3中的B中白色处为绿色荧光，D中白色处为红色荧光)，不经几丁质诱导则未观察到相应的荧光(图3中的A和C)。结果显示，胶体几丁质诱导可启动报告基因EGFP和RFP在洋葱表皮细胞中特异表达，本发明的Ptchi2启动子在植物中对基因表达具有诱导调控作用。

三Ptchi2酵母表达载体的构建及启动活性鉴定

提取Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos和pPIC9K质粒，分别用限制性内切酶Sac Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后回收Ptchi2-EGFP-Tnos表达盒、Ptchi2-RFP-Tnos表达盒和9.3kb的pIC9K目的条带。分别将回收的Ptchi2-EGFP-Tnos表达盒、Ptchi2-RFP-Tnos表达盒与9.3kb的pPIC9K用T4DNA Ligase连接(分别用Ptchi2-EGFP-Tnos表达盒、Ptchi2-RFP-Tnos表达盒替换掉pPIC9K载体中的的Sac Ⅰ酶切位点至EcoR Ⅰ酶切位点区域)，获得酵母表达载体pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos、pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos。

酵母表达载体用SalⅠ线性化，纯化试剂盒纯化。电压1500V、电击时间0.5ms电转化毕赤酵母GS115。分别获得酵母工程菌GS115-Ptchi2-EGFP、GS115-Ptchi2-RFP。

将转化子分别接种到含有800μL YPD的1.5mL离心管中，28℃，180r/min摇培24h。10000r/min离心1min，用ddH₂O清洗10遍左右，最后用100μL ddH₂O重悬菌体，备用。

(1)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培养基，450μL浓度为20mg/mL的葡萄糖，加入到1.5mL离心管中，28℃，180r/min摇培。

(2)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培养基，20μL浓度为25mg/mL的胶体几丁质，430μL蒸馏水，加入到1.5mL离心管中，28℃，180r/min摇培。

(3)取10μL以上菌液，50μL 50×SM培养基，20μL浓度为25mg/mL的胶体几丁质，50μL浓度为200mg/mL的葡萄糖，380μL蒸馏水，加入到1.5mL离心管中，28℃，180r/min摇培。

每组试验3个重复。每隔12h取样10μL，直到216h，制片，用荧光显微镜进行荧光检测(图4，图5)。结果如下：

(1)用添加葡萄糖的SM培养基进行培养，酵母未观察到荧光。说明仅有葡萄糖的SM 培养基不能使Ptchi2启动EGFP和RFP的表达。

(2)添加胶体几丁质的SM培养基，诱导培养第4d-9d酵母能够观察到绿色或红色荧光。说明：在毕赤酵母GS115中，从诱导开始第4d-9d，胶体几丁质也可以诱导Ptchi2启动EGFP和RFP的的高效表达。

(3)胶体几丁质和葡萄糖都添加的SM培养基，诱导培养第4d-9d酵母能够观察到绿色或红色荧光。说明：在毕赤酵母GS115中，同时添加胶体几丁质和葡萄糖，胶体几丁质仍然可以诱导Ptchi2启动EGFP和RFP的的高效表达，对于表达时间无影响，表达效率无影响。

综上所述，Ptchi2启动子在酵母中不受葡萄糖抑制，可以被较低浓度的胶体几丁质诱导，启动EGFP和RFP的高效表达。

实施例2棘孢木霉几丁质酶基因启动子Ptchi2核心区域鉴定

一、启动子Ptchi2缺失载体的构建和洋葱表皮细胞瞬时表达验证

根据已知的启动子全序列和生物信息学分析，设计序列缺失引物，见表1。

表1.缺失突变引物的设计

以pMD18-T-Ptchi2Vector质粒为模板，分别以p1s206、p1s401、p1s604、p1s780、p1s829、p1s901为系列缺失上游引物，4POA或p1a1042为下游引物，进行PCR扩增，PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测、胶回收，并且与克隆载体pMD18-T Vector进行连接，获得启动子Ptchi2系列缺失突变体克隆载体。分别将Ptchi2系列缺失突变体克隆载体和Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos质粒、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos质粒用限制性内切酶Sac Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收目的条带，用T4DNA Ligase将Ptchi2系列缺失突变体分别与切除Ptchi2的Pcb302-Ptchi2-EGFP-Tnos载体、Pcb302-Ptchi2-RFP-Tnos载体连接，获得Ptchi2系列缺失突变体表达载体。转化农杆菌EHA105，获得系列含有不同Ptchi2缺失突变体表达载体的农杆菌EHA105。利用根癌农杆菌介导的洋葱表皮细胞瞬时表达体系，检测不同启动子Ptchi2缺失突变体几丁质诱导启动活性。

实验结果(图6)显示(图6中的B中白色处为绿色荧光，D中白色处为红色荧光，A和C无荧光)：启动子5’端0-829bp个碱基缺失时，胶体几丁质均可以正常诱导启动EGFP 和RFP的高效表达；而5’端缺失901bp时，胶体几丁质不能诱导启动EGFP和RFP表达。Ptchi2启动子829bp-1042bp区域，具有与全长Ptchi2相同的几丁质诱导启动活性，说明829bp-1042bp区域是Ptchi2启动子的核心区域，响应几丁质诱导的顺式作用元件在829bp-901bp之间。

二、启动子Ptchi2核心区酵母表达载体的构建及启动活性鉴定

克隆启动子Ptchi2核心区(829bp-1042bp)，替换载体pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos、pPIC9K-Ptchi2-RFP-Tnos中的全长Ptchi2区域，构建含启动子Ptchi2核心区酵母表达载体，电转化毕赤酵母GS115选取阳性克隆，进行诱导培养，荧光显微镜观察结果。

(1)只添加葡萄糖的SM培养基进行培养时，观察不到荧光。

(2)添加胶体几丁质的SM培养基或同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基，诱导培养4-9d，酵母细胞都可以观察到相应的荧光(如图7，其中的B、C中白色处为绿色荧光，E、F中白色处为红色荧光，A和D无荧光)。试验结果与洋葱瞬时表达结果一致。

实施例3顺式作用元件鉴定与分析

根据启动子Ptchi2的核心区分析，设计定点碱基置换突变引物对和定点碱基缺失引物对，如表2。

表2.定点突变分析所需引物表

按照OneTube Mutagenesis Kit(北京艾德莱生物科技有限公司)说明书，分别以Pcb302-p1s829-EGFP-Tnos(p1s829代表Ptchi2启动子的829bp-1042bp区域的序列)、Pcb302-p1s829-RFP-Tnos(p1s829代表Ptchi2启动子的829bp-1042bp区域的序列)质粒为模板，采用表2中的序列引物对，进行PCR扩增，扩增体系如下：

PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸12min，共进行24个循环；72℃延伸10min。

于20μL PCR产物中加0.5μL Dpn Ⅰ酶，充分混匀，继续PCR仪器上37℃孵育3小时，消化PCR产物，取10μL消化产物转化大肠杆菌DH5α。

挑取阳性克隆，测序鉴定，提取测序正确的突变转化子质粒，采用冻融法转化农杆菌EHA105。采用洋葱表皮细胞瞬时表达体系检测诱导启动活性。

结果发现：在829bp-1042bp区域，缺失869bp-896bp 28个碱基、或缺失869bp-888bp 20个碱基，诱导表达时检测不到荧光，说明869bp-888bp区域20个碱基含有诱导所必须的顺式作用元件，该区域含有2个“ACTTGTTCA”。单独将869bp-877bp 9个碱基突变为“GACGTCGTC”或886bp-890bp 5个碱基突变为“GTCGA”，保持几丁质诱导启动活性。单独缺失869bp-877bp 9个碱基或单独缺失880bp-890bp 11个碱基，保持几丁质诱导启动活性；在缺失880bp-890bp 11个碱基的基础上，将869bp-877bp区域由9个碱基组成的“ACTTGTTCA”突变为“GACGTCGTC”，则失去几丁质诱导启动活性。说明启动子核心区“ACTTGTTCA”序列(命名为CSICAE)为响应几丁质诱导所必须，是Ptchi2启动子响应几丁质诱导的顺式作用元件。

实施例4含CSICAE杂合启动子构建及诱导活性鉴定

一、含CSICAE杂合启动子植物表达载体的构建及诱导活性鉴定

pROKⅡ质粒为模板，以RH35SS：CGAGCTCACTTGTTCATTACTTGTTCATCGCAAGACCCTTCCTCT SEQ ID No:28和RH35SA：GCTCTAGACCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:29为引物，进行融合PCR扩增，将CSICAE与花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子核心序列融合，扩增体系如下：

PCR反应程序为94℃预变性5min；94℃变性45s，46℃退火45s，72℃延伸20s，5个循环；94℃变性45s，53℃退火45s；72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。

pROKⅡ质粒为模板，以35SS：CgagctcCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGT SEQ ID No:30和35SA：GctctagaCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:31为引物，扩增CaMV35S序列。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收产物转化大肠杆菌DH5α。挑取单菌落，用特异性引物进行PCR验证，阳性克隆测序验证，提取质粒分别用Sac Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收目的片段；Pcb302-p1s829-EGFP-Tnos质粒用Sac Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，回收载体片段。连接转化大肠杆菌DH5α，提取转化子质粒，获得含CSICAE杂合启动子植物表达载体和含CaMV35S启动子核心序列的植物表达载体，采用冻融法转化农杆菌EHA105。采用洋葱表皮细胞瞬时表达体系检测诱导启动活性。

结果发现，含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子可以被胶体几丁质诱导启动EGFP报告基因表达，检测到绿色荧光；不含CSICAE的CaMV35S启动子不能被胶体几丁质，检测不到绿色荧光。采用同样的方法，构建只含有1个CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子，仍然可以被胶体几丁质诱导启动EGFP报告基因表达，检测到绿色荧光；不含CSICAE的CaMV35S启动子不能被胶体几丁质诱导启动EGFP报告基因表达，检测不到绿色荧光(图8)。证明CSICAE是响应几丁质诱导的顺式作用元件。

二、含CSICAE杂合启动子酵母表达载体的构建及诱导活性鉴定

进一步以JRH35SS：CGAGCTCACTTGTTCATTACTTGTTCATCGCAAGACCCTTCCTCT SEQ ID No:32和JRH35SA：CGGAATTCCCCGTGTTCTCTCCAAATGAAATGAACT SEQ ID No:33为引物，以“实施例4、一”构建的含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子为模板，PCR扩增含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子。采用“实施例1、三”中的方法，用含有CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子替换载体pPIC9K-Ptchi2-EGFP-Tnos中的全长Ptchi2区域，构建含CSICAE和CaMV35S启动子核心序列的杂合启动子的酵母表达载体，电转化毕赤酵母GS115选取阳性克隆，进行诱导培养。荧光显微观察结果发现：酵母在添加葡萄糖的SM培养基进行培养时，观察不到荧光；在添加胶体几丁质的SM培养基上培养，或同时添加胶体几丁质和葡萄糖的SM培养基诱导培养4-9d，可以观察到绿色荧光(图9)。

该结果进一步证明CSICAE是响应几丁质诱导的顺式作用元件；同时也证明CSICAE不仅在植物中可诱导调控基因表达，并且在真菌酵母中也可诱导调控基因表达。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 特异性顺式作用元件及含该顺式作用元件的启动子和核酸构建体及其应用

<130>

<160> 33

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 几丁质特异诱导表达启动子Ptchi2

<400> 1

aactcgttga ttggggagga taatagcagt ttcgtcaagc tcctgctaga atacggtgct 60

gaaattgatg cagcagatat caacggcaaa actccgctta tccacgcttc cagtgtcggg 120

catgagaata cagttaaagt gctgctagag tatggcgccc aagtcaatgc agcagataac 180

gacggccaga cagcactaat gaaggctgca tgttccgaag acttgtttgg gaaggctaat 240

atcaacaccg tcaagttgct gctagaatat ggagccgaaa ttgatgcggc agattgtggc 300

ggccagacag cacttatttg tactgcatat gctgggaacg aggatagcgt caggctactg 360

ctgcaaaatg gcgctcaagt taatgcagca gatacaagtg gtttcacagc gttattctgg 420

gcaaattcaa gggggaagag agaacttatc aagctgctgc tggagcacgg cgctgctgat 480

ccaggcactt acatgatgca tataacataa tgtgggctat aagatagaaa tcaggcacta 540

cctacctagc catcaagcac agctgaggcg acaagcagac aaaacatatc agcagattgc 600

attttgtact ctataaaaga gccaattggc caacatgaat ttggtcaact agcttgctcc 660

atatcttcct gctaaatagg aaaagcaagt ctacacatgg gtattggctc gtttgtgggc 720

atggacaagc aaaagatgag ctgtcgatga ggcggtgctg gccagtcagc agcatcgaca 780

gcgcatacaa agtggaggct ggggcgaaag ccgcgacagc atctgaggcc gccattaagc 840

tgttccacca tgactgggtc gccaagcaac ttgttcatta cttgttcatg ttattccaaa 900

gaggacatag agcaagggtt catatttatg tttgccatat aagtatataa agggcagcca 960

tttgttcaaa gccacttgct tcccaacaaa gctcctgttg gataagtacc agcaaacata 1020

tttcgtcata gggatctagc tgtccccaaa tacctcattc tccttgcggg cctcatttta 1080

gcattgtctt tcataccaat ctccaattac ttttcatcac caataacc 1128

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aactcgttga ttggggagga taatagcag 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttattggt gatgaaaagt aattggagat 30

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgagctcact agtaactcgt tgattgggga ggataatagc ag 42

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctctagagg ttattggtga tgaaaagtta attggagat 39

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgagctcctg catgttccga agac 24

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgagctcgtt tcacagcgtt attctg 26

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagctcatg tactctataa aagagccaat 30

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgagctcagc gcatacaaag tgga 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgagctcccg ccattaagct gttc 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgagctcgag gacatagagc aagggtt 27

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gctctagaca gctagatccc tatgacg 27

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gctctagagg ttattggtga tgaaaagt 28

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgccaagca gacgtcgtct tacttgttca tgttattc 38

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gaacaagtaa gacgacgtct gcttggcgac ccagtcatg 39

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcgccaagca gacgtcgtct tttattccaa agaggac 37

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctctttggaa taaaagacga cgtctgcttg gcgacccagt catggt 46

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gttcattact tgtgtcgatt attccaaaga ggacatagag caagg 45

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctctttggaa taatcgacac aagtaatgaa caagttgctt ggc 43

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gggtcgccaa gcattacttg ttcatgttat tccaaagagg 40

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

catgaacaag taatgcttgg cgacccagtc atggtgg 37

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gcaacttgtt cattttattc caaagaggac atagagcaag gg 42

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctctttgga ataaaatgaa caagttgctt ggcgacccag 40

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gggtcgccaa gcacaaagag gacatagagc aagggttc 38

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ctatgtcctc tttgtgcttg gcgacccagt catggtgg 38

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gggtcgccaa gcagttattc caaagaggac atagagc 37

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cctctttgga ataactgctt ggcgacccag tcatggtgg 39

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgagctcact tgttcattac ttgttcatcg caagaccctt cctct 45

<210> 29

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gctctagacc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36

<210> 30

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cgagctccgc aagacccttc ctctatataa ggaagt 36

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gctctagacc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

cgagctcact tgttcattac ttgttcatcg caagaccctt cctct 45

<210> 33

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggaattccc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaact 36