用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌LAMP引物组合及其应用。

背景技术：

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物。近年来，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，随着抗生素使用量的加大，细菌耐药的情况也越发严重。抗生素种类繁多，作用机制多样。甲氧西林(methicillin)为第一个应用于临床的耐青霉素酶半合成青霉素，对葡萄球菌产生的青霉素酶较其它耐酶青霉素稳定。

金黄色葡萄球菌为临床常见的病原菌，具有较强的致病力，能引起皮肤软组织感染、血流感染及全身各脏器感染等。1961年首次分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，其对所有β-内酰胺类抗生素耐药，并对大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等多种抗菌药物多数耐药，因此，导致该菌引起的感染治疗困难，病死率高。从20世纪80年代开始至今，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染者逐年增多并日益成为感染的主要病原菌之一。由于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive staphylococcus aureus，MSSA)和MRSA的治疗方式等有极大差异，因此临床上必须检测待测菌是否为MRSA。MRSA通常被定义为携带mecA基因的金黄色葡萄球菌和/或苯唑西林MIC≥4mg·L-1的金黄色葡萄球菌，目前鉴定MRSA的方法主要有纸片扩散法、微量肉汤稀释法、琼脂稀释法和苯唑西林平皿筛选法，但是这些检测方法均具有检测时间长(一般24h左右)和准确率低的缺点。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展LAMP试剂盒的应用推广。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了一种引物组合，由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3可为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。

所述引物Ⅰ-B3可为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物Ⅰ-FIP可为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

所述引物Ⅰ-BIP可为如下(a7)或(a8)：

(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物Ⅰ-LF可为如下(a9)或(a10)：

(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。

所述引物Ⅰ-LB可为如下(a11)或(a12)：

(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。

本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c2)或(c3)：

(c2)用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；

(c3)用于检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c2)或(c3)：

(c2)用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；

(c3)用于检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测菌的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果采用所述引物组合不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌不为或候选不为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

本发明还保护一种检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：

如果采用所述引物组合可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果采用所述引物组合不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

以上任一所述方法中，采用所述引物组合时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。

本发明还保护所述引物组合在检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。

以上任一所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具体可为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌TR558(Ling-Xiang Zhu，Zhi-Wei Zhang，at al.Use of a DNAMicroarray for Simultaneous Detection of Antibiotic Resistance Genes among Staphylococcal Clinical Isolates.JOURNAL OF CLINCAL MICROBIOLOGY，Nov.2007，p.3514-3521.)。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。

本发明提供的引物组合用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

附图说明

图1为实施例2的实验结果。

图2为实施例3的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌TR558记载于如下文献中：Ling-Xiang Zhu，Zhi-Wei Zhang，at al.Use of a DNAMicroarray for Simultaneous Detection of Antibiotic Resistance Genes among Staphylococcal Clinical Isolates.JOURNAL OF CLINCAL MICROBIOLOGY，Nov.2007，p.3514-3521.

反应液为博奥生物集团有限公司的产品，产品目录号为CP.440020。

DNA拷贝数的计算方法如下：

1A260吸光度值＝dsDNA 50μg/ml；

核酸浓度＝(OD260)×(稀释倍数)×(50)＝x ng/μl；

平均分子量(MW)代表克/摩尔，单位道尔顿(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩尔＝6.02×10²³；

平均分子量(MW):dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；

拷贝数计算公式:

(6.02×10²³copies/摩尔)×(x ng/μl×10^-9)/(DNA长度×660)＝copies/μl。

金黄色葡萄球菌的基因组DNA长度为2.70Mb。

实施例1、试剂盒的制备

试剂盒由1个LAMP引物组组成，该引物组用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物组如下：

引物Ⅰ-F3：5’-CATTGATCGCAACGTTCAA-3’(序列表中序列1)；

引物Ⅰ-B3：5’-AGATACATTCTTTGGAACGATG-3’(序列表中序列2)；

引物Ⅰ-FIP：5’-TCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGATTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGT-3’(序列表中序列3)；

引物Ⅰ-BIP：5’-AGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGACCTATCTCATATGCTGTTCCTGTA-3’(序列表中序列4)；

引物Ⅰ-LF：5’-CGCTATGATCCCAATCTA-3’(序列表中序列5)；

引物Ⅰ-LB：5’-AACAATGTGGAATTGGC-3’(序列表中序列6)。

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的引物组命名为引物组合。

实施例2、灵敏度

待测样本：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌TR558

1、提取待测样本的基因组DNA，用无菌水进行梯度稀释，得到各个稀释液。

2、以步骤1得到的稀释液为模板，采用实施例1制备的引物组合进行环介导等温扩增。

反应体系(10μL)：7.0μL反应液、1μL引物混合物、1μL稀释液(1μL稀释液中含有的基因组拷贝数分别为10³、5×10²、10²或10¹)，补水至10μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物Ⅰ-F3和引物Ⅰ-B3的终浓度均为0.5μM，引物Ⅰ-FIP和引物Ⅰ-BIP的终浓度均为2μM，引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的终浓度均为1μM。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

如果在50min内出现阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)，表明反应体系中的相应基因组含量可以被检测出来。如果在50min内没有出现阳性扩增曲线，表明反应体系中的相应基因组含量不能被检测出来。

按照上述方法，将稀释液替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。

实验结果见图1(“S型”扩增曲线分别为含有基因组拷贝数为10³的稀释液(图1中标注为10³)和含有基因组拷贝数为5×10²的稀释液(图1中标注为5×10²)，非“S型”扩增曲线为含有基因组拷贝数为10²的稀释液、含有基因组拷贝数为10¹的稀释液或空白对照)。结果表明，实施例1制备的引物组合检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌TR558的灵敏度为5×10²个拷贝数/反应体系。

实施例3、应用

待测样本为已通过药敏鉴定及PCR测序鉴定确认含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的人的脓液。

1、提取待测样本的总DNA。

2、以步骤1提取的待测样本的总DNA为模板，采用实施例1制备的引物组合进行环介导等温扩增。

反应体系(10μL)：7.0μL反应液、1μL引物混合物、1μL待测样本的总DNA，补水至10μL。引物混合物即引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，引物Ⅰ-F3和引物Ⅰ-B3的终浓度均为0.5μM，引物Ⅰ-FIP和引物Ⅰ-BIP的终浓度均为2μM，引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的终浓度均为1μM。

反应条件：65℃恒温50min。

反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。

按照上述方法，将待测样本的总DNA替换为无菌水，其它步骤均不变，作为空白对照。

实验结果见图2。采用实施例1制备的引物组合检测待测样本的时候显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为“S型”扩增曲线)，检测为空白对照的时候不显示阳性扩增曲线(即扩增曲线为非“S型”扩增曲线)，与实际情况完全一致。

以上结果表明，利用本发明提供的引物组合可以进行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测，结果准确可靠。

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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