一对控制甜瓜有毛/无毛性状的等位基因GL/gl的制作方法

文档序号：12411832阅读：320来源：国知局

本发明属于基因工程领域，具体涉及一对控制甜瓜毛状体发育（有毛/无毛）的等位基因GL/gl。

背景技术：

甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科甜瓜属一年生作物，具有广泛的遗传多样性和表型多样性。我国是世界上最早栽培甜瓜的国家之一，也是世界上甜瓜栽培面积最大、产量最高的国家，甜瓜在我国已有3000多年的栽培历史，其中我国华北地区是薄皮甜瓜的次生起源中心。

甜瓜正常植株茎、叶、花萼、子房表面均覆有表皮毛，且为多细胞无腺体表皮毛。植物表皮毛具有一系列功能，它可以作为第一道屏障保护植物免受昆虫和病原体的侵害以及降低机械损伤和紫外光伤害等生物及非生物胁迫。但无毛材料也常有其特殊用途，如在与其同一个属的黄瓜中发现，无毛材料既可以减少农药残留（王桂玲等，黄瓜果瘤的遗传及SSR标记，植物学通报，2007，24 (2): 168–172），又可以增强对部分害虫的抗性（韩强等，无毛和有毛黄瓜幼苗抗蚜性鉴定，山东农业科学，2010，7: 74-76）；同时无毛性状非常适合作为形态标记，可作为整个生长期特别是苗期的遗传标记性状，用于瓜类作物杂交育种及杂交一代种子纯度的苗期快速鉴定（Foster RE，Glabrous，a new seedling marker in muskmelon，J Hered，1963，54: 113-114）。

美国学者Foster 1963年首次报道了甜瓜完全无毛突变体材料，发现该突变体的表皮细胞从大小、形状及数量上都与正常材料不同，但根毛发育与正常材料相同；进一步遗传分析结果表明，该无毛性状是由一对隐形单基因控制的（Foster RE，Glabrous，a new seedling marker in muskmelon，J Hered，1963，54: 113-114）。王惠林等（2003）报道了甜瓜茎蔓无刚毛突变性状，并对该性状与正常茎蔓的遗传关系进行了初步研究，证实甜瓜茎蔓无刚毛性状是由一对核基因控制的隐性性状（王惠林等，甜瓜茎蔓无刚毛突变体的选育及遗传分析，中国西瓜甜瓜，2003，(6) ：1- 2）。随后，尚建立等（2006）比较了甜瓜茎蔓光滑无毛突变材料与茎蔓无刚毛突变材料的表型性状，并对两者之间的遗传关系进行了研究，证实甜瓜茎蔓无刚毛基因和茎蔓光滑无毛基因是两对非等位基因，且茎蔓光滑无毛基因对茎蔓无刚毛基因存在隐形上位作用（尚建立等，甜瓜茎蔓无刚毛与光滑无毛性状的遗传关系分析，中国瓜菜，2006 (4) : 7- 9）。

总体而言，目前国内外对甜瓜无毛性状的研究报道较少，且仅停留在对其遗传规律分析和生理特性的研究上，而对于甜瓜表皮毛发育基因的定位、克隆及其形成的分子机制的研究仍属空白。因此，对甜瓜无毛性状进行精细定位并克隆，进一步研究其形成的分子机制，对甜瓜的基础研究和分子育种具有重要的理论和实践意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一对控制甜瓜毛状体有无的等位基因GL/gl，从而为研究甜瓜表皮毛形成的分子机制、甜瓜材料表型性状的分子鉴定、甜瓜种质筛选、鉴定及甜瓜分子标记辅助育种体系的建立提供应用基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个控制甜瓜无毛性状的基因gl，该基因在无毛材料中为隐性纯合（gl/gl），可抑制甜瓜毛状体的发育，导致植株表面光滑无毛，该基因序列全长5366bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

一个控制甜瓜有毛性状的基因GL，与甜瓜无毛性状基因gl互为等位基因，该基因在有毛材料中为显性纯合（GL/GL）或杂合（GL/gl），含有该基因的甜瓜的毛状体发育正常，植株表面覆盖毛状体，该基因序列全长5366bp，具体碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

所述控制甜瓜无毛性状的基因gl在甜瓜品种培育中的应用，利用该基因可培育无毛性状甜瓜新品种。

用于识别Gl和gl 的dCAPS分子标记，命名为dCAPS1，该分子标记基于Gl和gl的全长DNA序列差异设计开发，该分子标记在无毛材料中的PCR扩增产物为124bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；该标记在有毛材料中的PCR扩增产物为124bp，碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

比较SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列，SEQ ID NO.3序列和SEQ ID NO.4序列在21bp处有一个碱基突变；SEQ ID NO.4在16-21bp处有一个EcoR1的酶切位点，酶切产物大小108bp；而SEQ ID NO.3不含有该酶切位点，因此酶切后产物大小仍为124bp；因此根据PCR产物酶切后的条带大小，可有效区分gl/gl、GL/GL、GL/gl三种基因型。

所述对与无毛基因gl完全连锁的分子标记dCAPS1的检测方法，采用PCR产物酶切检测法，PCR扩增时，引物序列设计如下：

dCAPS1-F：5’- GGTTGCGGGAGATGGGAATT -3’，

dCAPS1-R：5’- TGAAACTCGTGAAGCTTCGGTTC -3’

对与无毛基因gl完全连锁的分子标记dCAPS1的检测方法，采用PCR产物酶切检测法，对该标记的PCR扩增产物进行EcoR1酶切，获得产物大小为124bp的为gl/gl基因型，植株表型表现为无毛；获得产物大小为108bp的为GL/GL基因型，植株表型表现为有毛；同时获得124bp和108bp产物的为GL/gl基因型，植株表型表现为有毛。

与无毛基因完全连锁的分子标记dCAPS1在甜瓜基因型检测及分子标记辅助育种中的应用，利用该分子标记，有助于检测甜瓜有毛性状的基因GL或甜瓜无毛性状的基因gl。

随着生活水平的提高，育种研究中越来越重视产品的品质性状。甜瓜无毛性状属于感官品质范畴，表皮光滑的无毛甜瓜品种，具有减少农药残留、减少虫卵附着、污染少、方便清洗、食用卫生等优点，因而是无公害水果发展的理想品种。而甜瓜无毛基因gl控制着表皮毛的形成，因而对该基因的深入研究将能够有效推动甜瓜品质育种进程。

另一方面，随着生物技术水平的不断发展，克隆目的基因的方法也越来越多样化，图位克隆的方法是利用分离群体的遗传连锁分析，通过构建高密度的遗传图谱，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域，进而克隆该基因。同时，分子标记是从DNA水平上对目标性状进行选择，具有高效、快速、不受环境条件影响等优点，因而利用与目的性状紧密连锁的分子标记进行标记辅助育种，是十分有效的育种方法，可在苗期进行选择，加快育种进程。因此，克隆无毛基因gl并开发与该基因完全连锁的分子标记将为甜瓜分子标记辅助育种打下坚实的基础。

本申请中所提供的dCAPS1分子标记，在有毛纯合材料（GL/GL）的扩增产物中有EcoR1的酶切位点，酶切切开后产物大小108bp；dCAPS1在有毛杂合材料（GL/gl）的扩增产物中一半有EcoR1的酶切位点，切开后产物大小108bp，一半没有EcoR1的酶切位点，PCR产物切不开，仍保持原始大小124bp，即dCAPS1在有毛杂合材料中的PCR产物酶切后同时有108bp和124bp两个条带；dCAPS1无毛材料（gl/gl）的扩增产物中没有EcoR1的酶切位点，酶切后产物大小仍为124bp。由于dCAPS1分子标记具有稳定性高、重复性好的优点，因而可在无毛基因gl的分子标记辅助育种体系的构建中起到关键作用。

总之，本发明利用重测序比对和分子标记开发技术，首次对甜瓜无毛性状进行了精细定位，进一步利用染色体步移实现了对GL/gl基因的最终克隆，对了解甜瓜表皮毛形成机制及其调控网络具有重要意义，为研究甜瓜表皮毛发育调控机理打下了坚实的基础；同时根据该基因在有毛材料和无毛材料中的序列差异，开发了针对该基因的稳定的特异功能标记dCAPS1，可简便高效地应用于分子标记辅助育种，为甜瓜分子标记辅助育种体系的建立提供保障。

附图说明

图1是甜瓜无毛基因gl图位克隆的流程图，其中gl代表无毛基因；

图2是dCAPS1在自然群体中PCR产物的酶切电泳图，其中M 代表marker；1为正常有毛植株材料M68；2为无毛植株材料NSL73046；其余条带为从本实验室保存的种质材料中随机选取的23份自然群体材料（由于材料较多，但结果一致，因此对于条带对应种质材料不再详细说明），材料表型都是正常有毛。

具体实施方式

下面结合申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中生物材料、实验试剂及相关实验背景情况简要介绍如下。

生物材料：

甜瓜无毛材料NSL73046（母本），由美国农业部USDA种质资源中心提供，茎蔓表面、叶柄、叶片及子房上均无刚毛和茸毛，用手触摸非常光滑；

甜瓜正常材料M68是由本课题组选育的自交系，其茎蔓表面、叶柄、叶片、子房表面有刚毛和短茸毛，用手触摸较粗糙有扎手感；其表型性状除毛状体正常外，其余与NSL73046的表型基本一致，故采用M68做父本。

实验过程中，甜瓜亲本及群体种植于河南农业大学毛庄科教园区日光温室内，种植过程中，催芽后进行穴盘育苗，采用正常的甜瓜栽培管理方式，在三叶一心期对相关表型性状进行调查统计。

实验试剂：

实验过程中，PCR扩增用PCR MagicMix 3.0购于北京天恩泽基因科技有限公司；其它电泳与银染相关试剂如丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、AgNO₃、NaOH和甲醛等试剂购自北京索莱宝科技有限公司；

实验过程中的PCR扩增用引物（人工合成）及基因测序，由北京诺赛基因组研究中心有限公司提供完成。

实验设备：

PCR仪为珠海黑马医学仪器有限公司Hema9600型基因扩增仪；

电泳仪为JY300HC通用型电泳仪，由北京君意东方电泳设备有限公司生产；

电泳槽为HT-SCZ04A高通量垂直电泳槽，由北京鸿涛基业科技发展有限责任公司生产。

实施例1

本申请中对于甜瓜有毛/无毛基因的分析过程，包括遗传分离群体的构建、初步定位、精细定位及图位克隆等过程，定位结果如图1所示，相关实验过程简要介绍如下：

一、遗传分离群体的构建

以甜瓜无毛材料NSL73046作为母本，以甜瓜正常材料M68作为父本（需要解释的是，实验期间，从材料易得性及操作方便考虑，发明人以M68作为父本，在采用其他纯合有毛材料时，同样可以进行相关实验），利用这两个亲本配置了杂交组合，结果表明，获得的F₁代植株正常有毛。

从F₁代植株中选择10个单株，自交获得F₂代种子。然后随机选取1160粒F₂种子，用于遗传分析与基因定位。对这些F₂代个体的有毛/无毛表型进行鉴定，并用卡方测验进行验证。

结果表明：

初步定位时，随机选取438株F₂群体，其中有毛327株，无毛111株，X²=0.0274 （X²_0.05=3.84），符合3:1的分离比；

精细定位时，群体的1536株F₂群体，其中有毛1156株，无毛380株，X²=0.0556 （X²_0.05=3.84），同样符合3:1的分离比。

由此可知，甜瓜植株光滑无毛性状是由1对核基因控制的，将该基因命名为gl，有毛（GL）对无毛（gl）为显性。

二、基因的初步定位

采用BSA法进行初步定位，具体实验过程为：

（1）首先，制备基因池，具体为：

在上述步骤一的F₂群体中随机选取10个正常有毛单株与10个无毛单株，在三叶一心期从每个单株上面采集未展开的幼嫩叶片，采用CTAB法提取其基因组DNA，并混合制成有毛基因池和无毛基因池（有毛与有毛混合，无毛与无毛混合）。

（2）多态性筛选分析，具体为：

利用发明人前期从甜瓜全基因组开发的384对SSR引物对步骤（1）中所制备的两个基因池进行多态性筛选，将在两个基因池中获得的不同带型的标记称为多态性标记。

进一步，将筛选出的多态性SSR标记对438株F₂群体（步骤一中初步定位时所选择）进行基因型分析，将所获得的与无毛亲本相同带型的记作1，获得与有毛亲本相同带型的记作2，获得杂合带型的记作3。

上述分析过程中，PCR扩增时，10μL扩增体系设计如下：

基因池样品（基因组DNA，30ng/μL），1μL（约30ng）；

F、R引物，各0.5μL（引物浓度均为5 μmol/L）

PCR MagicMix，5.0μL；

ddH₂O ，3.0μL；

PCR扩增程序为：94℃、5min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35个循环；72℃ 5min。

需要解释的是，上述PCR扩增体系中的F、R引物分别代表一对引物中的前引物和后引物；384对SSR引物，由于这些引物与本申请欲保护主题并不直接关联，文本简明起见，不再详细说明。

对PCR扩增产物进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳检测时，聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液为0.6×TBE，200V恒压电泳1~1.5h。电泳结束后进行银染，以便观察和检测，银染方法为：

A、将带胶的玻璃板放入固定液中，在摇床上轻轻摇动直至指示剂退去颜色，其中固定液的组成为，冰醋酸：无水乙醇：蒸馏水的体积比为0.5:10:100；

B、用超纯水洗1~3min；

C、将冲洗后的胶板放入染色液中摇动10 min，染色液为0.2%硝酸银水溶液；

D、将染色后的胶板放入超纯水中漂洗30s，放入装有显影液的塑料盒中，轻轻摇动直至条带清晰呈现，显影液是在1L蒸馏水中加入15g NaOH和3mL甲醛混匀得到的；

E、最后放入自来水反复漂洗几次；

F、室温下干燥，然后拍照。

（3）基因初步定位，具体为：

结合438株初步定位群体表型调查数据和步骤（2）中最终SSR标记的分型结果，利用JoinMap3.0软件，对甜瓜无毛基因进行初步定位，结果获得2个与gl基因紧密连锁的SSR分子标记：CmSSR19480和CmSSR19495（相关编码为研究过程中发明人自行编码，并不具有特殊含义），这两个分子标记位于无毛基因gl基因的两端，分别与gl基因相距1.3cM和1.1cM（如图1所示）。

三、基因的精细定位

在步骤二初步定位基础上，发明人进一步对无毛基因gl基因进行了精细定位，具体过程简要介绍如下。

（1）亲本重测序和基因组比对

利用Illumina Hi-seq2000高通量测序平台对两亲本材料进行重测序，控制测序深度>20倍；以已公布的甜瓜全基因组序列（https://melonomics.net/genome/）在SSR标记CmSSR19480和CmSSR19495之间的区段的作为参考序列，利用网上公开的免费软件包BWA（http://bio-bwa.sourceforge.net/）分别将两个亲本的重测序序列和候选区段进行比对，找到两个亲本在候选区段的差异位点。

（2）精细定位

比较两亲本基因组在初步定位的候选区段内的序列差异，选择序列差异较大如3个碱基以上的插入或者缺失位点，然后利用在线软件Primer3（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）设计引物开发了7对Indel标记，命名为Indel1-Indel7。对438株F₂定位群体进行基因型分析，获得2个与gl 紧密连锁的标记，Indel1和Indel6，分别与gl基因相距0.3cM和0.1cM。进一步将作图群体扩大到1536株对无毛基因的进一步精细定位，找到两个与gl距离更近的标记，Indel2和Indel5，最终将gl基因定位于11.58kb的范围内（如图1所示）。

（3）图位克隆

对候选基因所在的11.58kb区段的序列进行基因预测，仅预测到1个基因，对所预测基因进行测序，测序结果即为无毛基因gl，全长5366bp，如SEQ ID NO.1所示；进一步在对应位置，测序获得其等位基因有毛基因GL基因，基因全长5366bp，如SEQ ID NO.2所示。对有毛基因GL基因和无毛基因gl基因的序列进行比对，发现该基因在两亲本间存在10个单碱基突变，其中6个位于内含子区域，4个位于外显子区域，无毛材料中外显子的第一个突变是由TCA突变为TAA，造成该基因在无毛材料中提前终止。

实施例2

在实施例1测序结果基础上，基于GL和gl的外显子TCA-TAA突变位点，可以设计一个用于识别Gl和gl 基因的dCAPS分子标记，命名为dCAPS1，利用所述dCAPS1分子标记进行PCR扩增时，引物序列为：

dCAPS1-F：5’ GGTTGCGGGAGATGGGAATT 3’

dCAPS1-R：5’ TGAAACTCGTGAAGCTTCGGTTC 3’；

利用该引物对，在无毛亲本材料中的PCR扩增产物为124bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示；在有毛亲本中的PCR扩增序列长124bp，碱基序列如SEQ ID NO.4所示；

比较SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列，SEQ ID NO.3序列和SEQ ID NO.4序列在21bp处有一个碱基突变，因此SEQ ID NO.4在16-21bp处有一个EcoR1的酶切位点，即，该序列含有限制性内切酶EcoR1的酶切位点5’-GAATTC-3’，因此利用EcoR1对其酶切产物进行酶切后，其产物大小为108bp；

而SEQ ID NO.3不含限制性内切酶EcoR1的酶切位点，因此酶切后产物大小仍为124bp；因此根据PCR产物酶切后的条带大小，可有效区分gl/gl、GL/GL、GL/gl三种基因型。

换言之，对dCAPS1分子标记的PCR产物进行酶切验证，有毛亲本（GL/GL）中有EcoR1的酶切位点，PCR扩增后的酶切产物大小为108bp；无毛亲本（gl/gl）因在酶切位点区域发生碱基突变而没有EcoR1的酶切位点，PCR产物切不开，仍保持原始大小124bp。基于此原理基础，dCAPS1分子标记可有效区分三种基因型GL/GL（有毛）、GL/gl（有毛）、gl/gl（无毛）。

在上述实验基础上，以发明人所收集来自世界各地的甜瓜种质材料中，随机选择23份材料为例（具体材料信息如下表所示，需要解释的是，所述甜瓜种质材料均为发明人工作过程中搜集所得，相关种质材料在国内及国外部分专业种质库中亦有保藏，加上下述工作仅为实验验证，相关种质材料与本申请保护主题并不具有直接关联性，因而仅提供了这些种质材料的基本信息），对dCAPS1分子标记功能进行了进一步验证。这些自然群体的甜瓜种质材料都为正常有毛材料：

。

对dCAPS1标记在两亲本和自然群体中的PCR产物进行酶切验证，酶切体系设计如下：

PCR产物，2μL；

10×Buffer EcoR1，1μL；

EcoR1，1μL；

Nuclease-free water（ddH₂O），6μL；

37℃酶切10h。

结果如图2所示。从图2中可以看出，对PCR产物酶切后，除M68为124bp的一条带外，其他所有材料都是只有108bp的条带，说明其他材料都为GL/GL基因型。基于此结果，表明dCAPS1分子标记能有效的区分有毛材料和无毛材料，同时也说明该基因确实是控制有毛/无毛性状的目标基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 一对控制甜瓜有毛/无毛性状的等位基因GL/gl

<130> none

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5366

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 1

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atgagagacg atgattttga caacaaatca ggtgcagaaa tcttggaatc tgcttgtgga 120

attgaccaac aacaacaacg ttctaaaaag aaacgttaca atcgtcatac acaacatcaa 180

atccaagaaa tggaagcgta agtcgtctgg actacaccta tccttttttt ttttttcctt 240

tttttccttc agttaaacgg ataaaaatct caatgttatt tttttgtttc atttgtcaga 300

ttctttaagg aatgtcctca cccagatgat aagcagagaa tggagctgag tcgtgagctg 360

gggttggagc cattgcaagt caagttttgg tttcaaaaca aacgcacaca aatgaaggtg 420

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ccgctgtgat gcgtgaaagc ccatga 5366

<210> 2

<211> 5366

<212> DNA

<213> Cucumis melo

<400> 2