本发明涉及基因扩增技术，尤其涉及一种人类线粒体的全基因组扩增方法。
背景技术：
：线粒体DNA(mtDNA)是细胞的第二套遗传物质。人类的mtDNA共16569个核苷酸，呈双链环状，其中有37个基因，编码13种蛋白质。mtDNA突变率高于核DNA，并且缺乏修复能力。mtDNA突变会引起一系列遗传病，例如Leber遗传性视神经病(LHON)、肌阵挛性癫痫伴碎红肌纤维病(MERRF)等。通过选择合适的引物，对线粒体基因组全环进行扩增和测序，以寻找可能的致病性mtDNA突变。选用多对引物对线粒体基因组全环进行扩增的技术存在以下缺陷：首先，核基因组中存在线粒体假基因，若引物扩增区域较短，引物极易与核基因组DNA结合，造成非特异扩增，实验结果无法排除假基因的干扰；其次，部分遗传病是由mtDNA大片段重复或缺失造成的，若选用多对引物扩增，得到的数个DNA片段无法进行重复或缺失的分析，无法准确辅助诊断病因。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，为了覆盖mtDNA全长，准确读取变异信息，并有效排除假基因的干扰，本发明提供一种人类线粒体的全基因组扩增方法，使用一对引物代替多对引物对mtDNA全环进行扩增。本发明的目的是通过以下方案实现：一种用于人类线粒体的全基因组扩增的引物对，所述引物对如下：mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG。本发明的另一方面为一种人类线粒体的全基因组扩增方法，采用上述引物对，以人全基因DNA为模板，进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测。优选地，所述PCR扩增时，PCR反应体系为：优选地，所述PCR扩增时，退火温度为68-69℃。优选地，所述PCR扩增时，PCR反应条件为94℃预变性1分钟；98℃变性10秒，68℃退火延伸16分钟，45个循环；72℃再延伸10分钟。优选地，所述琼脂糖凝胶为1.2％琼脂糖凝胶。优选地，所述人全基因DNA采用如下步骤提取：(1)分装400μL红细胞裂解液到1.5mL离心管，加入200μL全血，混匀；56℃孵育10min；(2)13000g离心1min，弃上清液，加入200μL红细胞裂解液，混匀后加入10μLProteaseK，混匀；(3)13000g离心1min，将上清液转移至干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；(4)13000g离心1min，弃上清，加入400μL70％乙醇漂洗沉淀；重复操作一次；(5)开盖使乙醇完全挥发，加入100μLDNase/RNase-Free去离子水使沉淀完全溶解。(6)使用分光光度计检测DNA浓度和纯度。优选地，所述人全基因DNA提取的步骤(6)中DNA浓度和纯度如下表所示：有益效果：mtDNA中存在保守序列，根据保守序列设计引物，即可得到人mtDNA全序列的通用扩增引物。由于mtDNA是环状的，根据mtDNA中的保守序列设计一对引物，进行长片段PCR扩增，即可得到mtDNA全序列。将使用此引物扩增的PCR产物进行纯化后构建文库，使用illumina测序平台进行测序，得到的序列拼接后与GeneBank中一致，证实为人线粒体环基因组全序列。本发明的人类线粒体的全基因组扩增方法相较于分段扩增，采用全环扩增的方法，优势是检测点突变的同时，可以发现线粒体DNA的大片段重复和缺失。线粒体DNA全基因组的扩增很大程度上依赖引物设计的优良与否，本发明提供了一种特定引物对，减少了人类线粒体DNA序列测序时大量消耗的引物设计和优化时间，提高了扩增的准确性及扩增效率。附图说明图1是不同样本使用琼脂糖凝胶电泳检测的结果图示；A1-B4为八例不同的血液样本，其中A3和A4样本患者具有Kearns-Sayre综合征临床表现。具体实施方式下面结合附图，对本发明进行详细的解释。提取人全基因DNA采用如下步骤：(1)分装400μL红细胞裂解液(天根生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒组分)到1.5mL离心管，加入200μL全血，混匀；56℃孵育10min；(2)13000g离心1min，弃上清液，加入200μL红细胞裂解液，混匀后加入10μLProteaseK(天根生化科技有限公司)，混匀；(3)13000g离心1min，将上清液转移至干净的1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，混匀，混匀后可看到DNA沉淀析出；(4)13000g离心1min，弃上清，加入400μL70％乙醇漂洗沉淀；重复操作一次；(5))开盖使乙醇完全挥发，加入100μLDNase/RNase-Free去离子水(天根生化科技有限公司)使沉淀完全溶解。(6)使用分光光度计检测DNA浓度和纯度，其记录结果如下表所示：一种人类线粒体的全基因组扩增方法，采用的引物对如下：mtDNA-F：ACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；mtDNA-R：AAGAGACAGCTGAACCCTCGTGG以上述方法提取的人全基因DNA为模板，进行PCR扩增,产物用琼脂糖凝胶电泳检测；所述琼脂糖凝胶为1.2％琼脂糖凝胶。所述PCR扩增时，PCR反应体系为：所述PCR扩增时，PCR反应条件为：步骤循环数温度(℃)时间11941minute2459810seconds6816minutes317210minutes414Hold即，所述PCR扩增时，PCR反应条件为94℃预变性1分钟；98℃变性10秒，68℃退火延伸16分钟，45个循环；72℃再延伸10分钟。如图1所示，mtDNA全长16569bp，图1中A1左侧为mtDNA标准Maker,A1，A2，B1-4共6例样本扩增产物均约为16kb，与mtDNA理论片段大小相符。A3和A4样本扩增产物片段明显小于16kb，经PCR产物纯化，构建文库并使用illumina平台测序，将测序结果与GeneBank比对后证实这两例样本分别存在9131bp和9546bp缺失，与临床初步诊断两位患者患有Kearns-Sayre综合征相符。约90％的Kearns-Sayre综合征患者由线粒体DNA缺失突变引起，缺失范围为1.1-10kb。反应时间为16分钟这是片段长度(16569bp)决定的，改变延伸时间，会导致得到的片段不是正确的结果。申请人尝试过改变退火温度，只有当退火温度为68℃，扩增成功率最高，约为90％；当退火温度为69℃时，扩增成功率约为80％，其他温度均远远低于70％(此处比例不合适，请发明人根据实际情况进行修改)，不利于本申请目的的实现。本申请的方法在试验过程中，根据不同的保守序列，共设计3对引物。除本发明所述引物外，另两对引物序列如下：hmtF:AACCAAACCCCAAAGACACC；hmtR:TTTATGGGGTGATGTGAGCC。1-mtF:CCTACAAGCCTCAGAGTACTTCGAGTCT；1-mtR:AGATGCCGTCGGAAATGGTGAAGGG。选取多例人基因组DNA样本，使用设计的3对引物进行扩增，扩增使用的PCR反应体系和反应条件与本发明一致。扩增产物使用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳检测16000bp左右有明显条带，无其他的非特异性扩增片段视为扩增成功。使用hmtF/hmtR引物对扩增成功率约为60％-70％，使用1-mtF/1-mtR引物对扩增成功率低于50％，使用mtDNA-F/mtDNA-R引物对扩增成功率约为90％。因此，申请人选定了mtDNA-F/mtDNA-R引物对作为本申请所述技术方案的引物对。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。<110>北京信诺佰世医学检验所有限公司<120>一种人类线粒体的全基因组扩增方法<130>101577<160>6<170>Premierprimer5.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1acttttaaccagtgaaattgacctgcc<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2aagagacagctgaaccctcgtgg<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3aaccaaaccccaaagacacc<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tttatggggtgatgtgagcc<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>5cctacaagcctcagagtacttcgagtct<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>6agatgccgtcggaaatggtgaaggg当前第1页1 2 3