一种水溶性蛇葡萄素聚合物的制作方法

本发明属于医药领域，具体而言涉及一种用于治疗肿瘤、抑制细菌感染、保肝护肝、降血糖、降血脂的水溶性蛇葡萄素聚合物产品。

背景技术：

蛇葡萄素（AMP）又名二氢杨梅素、双氢杨梅树皮素、福建茶素等，是一种多酚羟基双氢黄酮醇，属黄酮类化合物（见下式）。它资源丰富、来源广泛，存在乌头蛇葡萄、福建白茶、藤茶等植物中，其提取分析方法简单、毒性低、生物活性强，具有抗氧化、镇痛、止咳、抑菌、保肝护肝、降血糖、降血脂、增强人体免疫力、抗肿瘤等多方面的药理活性。目前，蛇葡萄素的研究热点在其抗肿瘤活性的开发上，对肿瘤细胞的体外抑制作用，但是在研究中，有的学者发现蛇葡萄素体内抗癌效果不理想，分析原因可能有以下几点：1.溶解性能差；2.稳定性较差；3.属于黄酮醇类化合物，存在着作用靶点较多、选择性不强、药理效应较弱等缺点。

蛇葡萄素结构式

（化学名为3,5,7,3’,4’,5’-六羟基-2,3-二氢黄酮，分子式为C₁₅H₁₂O₈）

针对蛇葡萄素上述问题，本课题组选用高分子聚合物：γ-聚谷氨酸（γ-PGA) 及α-聚谷氨酸（α-PGA)连接蛇葡萄素，γ-PGA是一种天然高分子，是由谷氨酸重复单元通过α-氨基与γ-羧基之间形成的酰胺键连接而成的。它是一种可生物降解、无毒、无免疫源性的药物载体。它的分子链上具有活性较高的侧链羧基，易于和一些抗癌药物形成高分子药物复合体，具有良好的药物学特性，能通过EPR效应使药物容易在肿瘤组织中积累。因此，γ-PGA是一类理想的体内医药用高分子材料。α-聚谷氨酸（α-PGA)为人工合成品，其合成方法及特性可参考专利文献[14]，其在药学上的应用类似γ-PGA。为促使蛇葡萄素这一天然物质及早应用于临床，本课题组拟采用将蛇葡萄素连接在高分子载体PGA的羧基端。通过该方法以期在保留蛇葡萄素生物作用的情况下，发挥高分子化合物的优势，达到提高溶解度，增加稳定性，延长体内生物半衰期，增强药效的目的，开发出符合临床需求的抗肿瘤新药，为癌症化疗开拓新前景。

参考文献

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技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种用于治疗肿瘤、抑菌、保肝护肝、降血糖、降血脂的水溶性聚谷氨酸-蛇葡萄素酯聚合物，将蛇葡萄素的羟基与聚谷氨酸自由羧基通过酯化反应形成酯键偶联，得到连接有蛇葡萄素的聚谷氨酸衍生物。

本发明提供了一种如式I或式II所示的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：含有与选自聚-l-谷氨酸、聚-d-谷氨酸、聚-d-l-谷氨酸的水溶性聚合物共轭的药物的组合物，每个重复单元中 R选自羟基或蛇葡萄素类基团；

式I (n=38～390)

(n=38～390) 式II

每个重复单元中 R独立地选自羟基、蛇葡萄素类基团中的一个；

其中蛇葡萄素类基团见下式III，

式III。

所述的聚谷氨酸的分子量为5000～50，000道尔顿 。

n为整数，并且使得所述聚谷氨酸衍生物的分子量为6000～600，000 道尔顿，优选为30，000～60，000 道尔顿；

所述的选自聚-l-谷氨酸、聚-d-谷氨酸或聚-d-l-谷氨酸的水溶性聚合物与蛇葡萄素7位羟基共轭。

本发明所述的组合物，它包含选自聚-l-谷氨酸、聚-d-谷氨酸或聚-d-l-谷氨酸的水溶性聚合物与蛇葡萄素的7位和3′位羟基双取代共轭物。

本发明所述的组合物，它包含选自聚-l-谷氨酸、聚-d-谷氨酸或聚-d-l-谷氨酸的水溶性聚合物与蛇葡萄素的7位和5′位羟基双取代共轭。

本发明所述的组合物，该组合物分散在药用载体溶液中。

本发明所述的组合物用于制备治疗患者癌症、细菌感染、高血脂、高血糖、肝脏疾病的药物中应用。

其中所述的癌症为乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、胃癌、结肠癌、头颈部癌或白血病。

本发明药物组合物，其中所述的共轭物含有蛇葡萄素高达32.3%。

本发明的药物组合物，其中所述的药物组合物含有5%～50%的蛇葡萄素。

所述聚谷氨酸衍生物中蛇葡萄素基团占所述聚谷氨酸衍生物的质量百分数为5%～50%，优选为 20～35％；

式I或式II所示的聚谷氨酸衍生物具有三类重复单元：

1) 自由的谷氨酸残基，即 R为羟基；

2) 连接有蛇葡萄素类化合物的谷氨酸残基；优选为蛇葡萄素通过 7位羟基与聚谷氨酸的羧基形成酯键连接在聚谷氨酸的聚合物长链上。

本发明的另一个目的是提供了制备上述聚谷氨酸衍生物的方法。制备过程中所用的小分子聚谷氨酸可以按照本发明中实施例中所述的方法制备，也可以按照现有技术详见参考文献[12]中的方法制备。

本发明中合成所用的试剂的英文简写定义如下 ：

AMP：蛇葡萄素

PGA：聚谷氨酸

DCC：二环己基碳二亚胺

EDC ：1- 乙基 -（3- 二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐

NHS ：N- 羟基丁二酰亚胺

DMAP：4- 二甲胺基吡啶

DMSO：二甲基亚砜

本发明中所述的聚谷氨酸衍生物可以按照以下方法制备：

聚谷氨酸与蛇葡萄素在缩合试剂和催化剂作用下反应，制备上述的目标聚谷氨酸衍生物。反应所用的缩合试剂为EDC和NHS或DCC，催化剂为DMAP。所用的溶剂二甲亚砜，反应完成后，反应液中合成产物分离萃取所用溶剂为乙醚。优选的制备方法为将蛇葡萄素溶解于二甲亚砜中，加入 DCC、DMAP 搅拌半小时。强烈搅拌下，将溶液缓慢滴加到聚谷氨酸的二甲亚砜的溶液中，40℃下反应 24小时。反应液加入乙醚，震荡，静置分离，取萃取分离的下层液体，氮气保护下快速抽滤、淋洗，冷冻真空干燥，得到聚谷氨酸蛇葡萄素酯(PGA-AMP)。

上述方法中，所用的缩合试剂为DCC或EDC和/或NHS，催化剂为DMAP。反应溶剂为极性非质子溶剂，选自二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮，优选二甲亚砜。分离萃取所用溶剂为乙醚。

本发明的又一个目的是提供了含有上述聚谷氨酸衍生物的药用组合物。

含有上述聚谷氨酸衍生物的药用组合物中含有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂以及等渗剂等任意组分。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域技术人员周知的。任何常用介质或试剂除了与该聚谷氨酸衍生物不相容外，应该可用于治疗组合物中。组合物中也可加入补充的活性成分。

本发明的又一个目的是提供了上述聚谷氨酸衍生物在制药中的用途。

本发明中的聚谷氨酸衍生物可以用于制备治疗癌症的药物。所述的癌症为乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、胃癌、结肠癌、头颈部癌或白血病。优选为肝癌、乳腺癌、肺癌。

本发明中的聚谷氨酸衍生物可以用于制备治疗细菌感染、高血脂、高血糖、肝脏疾病的药物的用途。

本发明的有益效果在于，通过在聚谷氨酸主链上连接蛇葡萄素，在保留蛇葡萄素生物作用的情况下，发挥高分子化合物的优势，达到提高溶解度，增加稳定性，延长体内生物半衰期，提高疗效的目的。

本发明制备的聚谷氨酸-蛇葡萄素酯(PGA-AMP)组合物，水溶性好，疗效提高。可以用于抗肿瘤药物的制备。

本发明制备的聚谷氨酸-蛇葡萄素酯组合物(PGA-AMP)，水溶性好，疗效提高。可以用于细菌感染、高血脂、高血糖、肝脏疾病的药物的制备。

附图说明

图1是 γ-PGA-AMP的紫外-可见吸收光谱。

图2是 AMP的紫外-可见吸收光谱。

图3是 γ-PGA-AMP的红外图谱。

图4是 蛇葡萄素的红外图谱。

图5是 PGA-AMP给药组、蛇葡萄素(AMP)对照组、溶剂对照组对人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞的作用图。

图6是PGA-AMP给药组、蛇葡萄素(AMP)对照组、溶剂对照组对人肝癌HepG-2肿瘤细胞的作用图。

图7是 PGA-AMP给药组、蛇葡萄素(AMP)对照组、溶剂对照组对人肺癌A549肿瘤细胞的作用图。

具体实施方式

下面的实施例是用以证明本发明的优选实施方式。本领域普通技术人员应该清楚下面实施例所公开的技术是本发明人发现的、在本发明实施中能很好发挥作用的技术，因此可将它视为优选的实施方式的一部分。但是，根据本发明，本领域普通技术人员还应知道，在不脱离本发明的内容和范围的前提下，可以对所公开的特殊实施方式进行多种修改，但仍可得到相同或相似的结果。

实施例 1：小分子γ-聚谷氨酸钠盐的制备

取100g生物合成的高分子γ-聚谷氨酸（γ-PGA，分子量约为200万，合成方法参考现有技术文献[12]）用500ml蒸馏水溶解，加入3倍体积的无水乙醇，静置得到γ-PGA沉淀，用水重新溶解、超滤，除去不溶物，对沉淀物进行冷冻干燥，得到白色块状γ-PGA。

取10g上述γ-PGA用蒸馏水配成2%（2g的PGA加水至100ml）γ-PGA水溶液，用盐酸调PH至2-3左右，高温高压（121℃、0.1MPa）作用20min，立即冰浴冷却，用NaOH调PH至7-8，进行冷冻干燥，得到白色棉絮状小分子γ-PGA钠盐。γ-PGA钠盐用蒸馏水配成2%γ-PGA钠盐水溶液，采用HCl将PH调回2.0左右，采用蒸馏水透析48h。对透析后的溶液进行冷冻干燥后，获得白色絮状小分子γ-PGA盐。

实施例 2 ：γ-PGA-AMP的合成

取蛇葡萄素（0.59g，约1.8mmol)溶于20ml二甲基亚砜中，于室温下搅拌溶解，取二环己基碳二亚胺(DCC)0.37g（约1.8mmol)，加入0.1gDMAP，再加入含有γ-PGA（1.24g，约9.37mmol)的二甲亚砜溶液180ml，置于集热式磁力搅拌器，40℃，反应进行3h后，采用TLC监测反应过程，反应进行24h，监测结果显示蛇葡萄素完全转变成聚合物共轭物。在反应液中加入10倍乙醚洗涤，震荡，4℃静置过夜，溶液分成两层，萃取，收集下层浅黄色溶液。将γ-PGA-AMP反应液进行冷冻干燥，得到黄色粉状产物1.02g，产率55.7%。

将聚谷氨酸蛇葡萄素溶解在0.5mol/L碳酸氢钠溶液中得到聚谷氨酸蛇葡萄素钠盐。用蒸馏水对聚谷氨酸蛇葡萄素钠盐的水溶液进行渗析，以去除分子量小的杂质和剩余的碳酸氢钠。将渗析物冷冻干燥得到白色粉末。

用紫外吸收检测方法测得这种聚谷氨酸蛇葡萄素钠盐中的蛇葡萄素的含32.3％(w/w)。

用相似方法增加所用的蛇葡萄素与聚谷氨酸的比例，可以提高生成的聚谷氨酸蛇葡萄素钠盐中的蛇葡萄素比例，所合成的聚合物中，蛇葡萄素量最高达到50％（w/w）。

合成产物的结构表征数据：

聚谷氨酸蛇葡萄素酯的紫外可见扫描谱图数据（见附图1）：最大吸收峰位于293.66nm，与AMP的紫外吸收光谱图（见附图2）相比，苯环上最大吸收峰红移约2nm。图1中200-270nm间显示了聚谷氨酸的羧基双键的多个吸收峰。

聚谷氨酸蛇葡萄素酯的红外扫描谱图数据：IR(KBr，cm^-1)

图3是γ-PGA-AMP的红外光谱图，由红外谱图可以看到ν_-CO-O-：1090cm^-1、1249cm^-1，羧酸ν_C=O：1646cm^-1，酯键ν_C=O：1728cm^-1；ν_C-H：2921cm^-1、975cm^-1、1352cm^-1、1315cm^-1。对比下图4蛇葡萄素的红外图谱，3630cm^-1处蛇葡萄素游离羟基的吸收峰已经消失，1650cm^-1处的-C=O基吸收由于取代基团的改变位移至1646cm^-1。这些都证明蛇葡萄素上的游离羟基与γ-PGA上的羧基已发生酯化反应。

聚谷氨酸蛇葡萄素酯的氢核磁共振图谱数据：

¹H NMR(500MHz，D2O) ：δ=4.9 (-CH₂CO- )，蛇葡萄素大环上信号峰δ=4.4 (C₂-H)，4.1 (C₃-H)，5.6（C₃-OH）5.65 和 5.9 (C₆-H)，5.9 (C₈-H)，6.4 (C_2’,6’-H)，8.0 (NH)和 8.9 (C_3’,5’- OH) ，8.3 (C_4’- OH)。聚谷氨酸链上的信号峰：δ=1.7-2.0 (aCH₂)，2.2 (bCH₂)，4.0（cCH₂）

实施例3：聚谷氨酸蛇葡萄素酯体外细胞毒性试验

细胞株及培养：人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549培养于含有体积百分数为10％的灭活新生牛血清、1x10⁵U•L^-1的青霉素和100mg•L^-1的链霉素的RPMI-1640培养基中，放置于37℃，CO₂含量为5％的培养箱内培养。2～3天离心换液或传代，取对数生长期细胞进行实验。

蛇葡萄素用无血清的培养液配制成浓度为200μg•mL^-1溶液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即用即配。γ-PGA-AMP也是直接用无血清的培养液溶解配制成200μg•mL^-1溶液实验所需浓度，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即用即配。加药终浓度为（200、100、50、25、12.5μg•ml^-1）。用含10%灭活小牛血清的RPMI medium 1640 培养液培养人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549，细胞接种于96孔培养板，每孔细胞个数约5×10³个，于37℃，湿度5%的CO₂气体中过夜培养。后在相同条件下让细胞培养于200μL的上述浓度药物溶液中24h。

细胞抑制率用MTT法检测，将MTT的PBS溶液(20μl, 5 mg• ml^-1)加入到每个孔中，在相同条件下培养4小时。在室温下，将板放在酶标仪上震荡后读取数据，每孔激发光为497 nm。以只加入培养基200uL而不加细胞的孔为空白孔，其他孔读数减去该空白孔数值，药物对癌细胞抑制率的计算方法如下式：

式中：A：受测试样组吸光度平均值；A₀：溶剂对照组吸光度平均值。

γ-PGA-AMP对细胞毒性结果见表1。测得γ-PGA-AMP加药浓度为200μg/ml时对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2，人肺癌细胞A549的抑制率分别为78.82%、76.14%、68.84%。计算得γ-PGA-AMP对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2及人肺癌A549细胞三种细胞的IC₅₀分别是42.2、30.6和54.7μM。

γ-PGA-AMP对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549细胞均有明显杀伤作用且随着药物浓度递增，杀伤细胞能力增强，敏感浓度为5~20μg/ml。γ-PGA-AMP、蛇葡萄素组、溶剂对照组对肿瘤细胞的毒性作用比较见图5-7。

表1．不同浓度γ-PGA-AMP对MCF-7、HepG-2及A549细胞毒性作用

Tab1. Effect of different concentration ofγ-PGA-AMP on the inhibition ratio

rate of cancer cell