1.一组用于快速检测ABCB1基因C3435T多态性的核酸,其特征在于,该核酸包括检测引物和检测探针,其中,所述检测引物包括野生型下游引物、突变型下游引物和公用上游引物,所述野生型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1,所述突变型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述公用上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求2所述的核酸,其特征在于,所述核酸还包括内部质控,其包括质控引物对和质控探针,所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示,所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
3.如权利要求1或2所述的核酸,其特征在于,所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物、和/或作为所述内部质控的质控阳性对照物,其中,所述野生型阳性对照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列,所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列,所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。
4.一种用于快速检测ABCB1基因C3435T多态性的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括如权利要求1-3中任一所述的核酸,其中,所述检测探针和质控探针的5'端连接荧光基团,3'端连接淬灭基团。
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,试剂盒还包括10×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、矿物油、阴性对照物:无核酸酶水,所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种,所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。
6.一种快速检测ABCB1基因C3435T多态性的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)从样品中提取DNA;
(2)对提取的所述DNA,同时进行野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增;其中,在所述野生型反应体系中检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;在所述突变型反应体系中检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示;所述公用检测探针的5'端连接荧光基团,3'端连接淬灭基团;
(3)数据采集和分析:将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上,通过实时荧光PCR仪收集信号,计算所述野生型反应体系和突变型反应体系的△Ct值来确定所述样品DNA的基因型。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针,所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示,所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,该质控探针的5'端连接有不同于所述检测探针的荧光基团,3'端连接有不同于所述检测探针的淬灭基团。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,在各自的所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中,各条引物和各条探针的终浓度均为100-1000nmol/L;所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种,所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种;
所述实时荧光PCR扩增的反应程序为:
第一阶段:95℃5min;
第二阶段:95℃5s,58℃30s,10个循环;
第三阶段:95℃5s,58℃30s,72℃30s,35个循环;
信号收集:第三阶段72℃时收集荧光信号。
9.如权利要求7或8所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,在各自所述野生型反应体系和所述突变型反应体系中,所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L,所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L,所述检测探针的终浓度为150nmol/L,所述质控引物对的终浓度均为150nmol/L,所述质控探针的终浓度为100nmol/L;所述检测探针的5'端连接FAM,3'端连接MGB,所述质控探针的5'端连接JOE,3'端连接BHQ1;
在所述步骤(3)中,检测样本的所述内部质控的JOE信号应达到设定阈值Ct值小于25,再确定所述样本DNA的基因型;否则应重新进行检测;
确定所述样品DNA的基因型,按照以下公式进行计算:
-2.5≤ΔCt=野生型Ct值-突变型Ct值≤2.5,判定为杂合型样本;
ΔCt=突变型Ct值-野生型Ct值>2.5,判定为野生型样本;
ΔCt=野生型Ct值-突变型Ct值>2.5,判定为突变型样本。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,还设有阳性对照和阴性对照,所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8核苷酸序列所示的野生型阳性对照物、含SEQ ID No.9核苷酸序列所示的突变型阳性对照物、和/或含有如SEQ ID No.10核苷酸序列所示的质控阳性对照物为模板,进行所述野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增;所述阴性对照为以水为模板,进行所述野生型反应体系和突变型反应体系的实时荧光PCR扩增;
在步骤(3)中,所述阳性对照的野生型反应体系和突变型反应体系的FAM均有明显的扩增曲线,和/或JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值≤25,符合要求;所述阴性对照的野生型反应体系和突变型反应体系的FAM、JOE均没有明显的扩增曲线,符合要求;否则,应重新进行检测。