1.一种基于高效低残糖发酵的大肠杆菌异丁醇合成菌株理性构建方法,其特征步骤如下:
(1)以以大肠杆菌MG1655为基础,构建高产异丁醇合成菌株E.coli LA09;
(2)以高产异丁醇的大肠杆菌E.coli LA09为研究对象,在不同浓度(35~40g/L)的初始葡萄糖浓度下分批发酵,采用代谢组学方法确定胞内的6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖这一代谢步骤为残糖转化的关键的限制因素;
(3)利用胞内的糖代谢通量分流来缓解限速步骤对细胞残糖转化的方法,通过合成生物学方法理性设计了来自运动单胞菌的异源人工Entner-Doudoroff(ED)糖代谢途径上下游片断;
(4)结合合成生物学方法以人工启动子对ED上下游途径进行匹配调节,构建高效人工ED途径的异丁醇合成菌株;
(5)对合成的高效低残糖大肠杆菌异丁醇合成菌株进行发酵试验,发酵液中残糖低于1g/L,符合生产目的;。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于:以大肠杆菌MG1655为宿主,按照CN201410814025.5申请专利的方法构建高产异丁醇合成菌株E.coli LA09;通过代谢组学技术解析胞内残糖转化的关键限制因素为6-磷酸果糖到1,6-二磷酸果糖这一代谢步骤。
3.权利要求1所述的方法,其特征在于:以运动单胞菌模式菌株Zymomonas mobilis ZM4基因组为模板,分别构建人工ED糖代谢途径的上下游片段,并导入高产异丁醇合成菌株LA09内,构建低残糖发酵菌株E.coli ED;其中ED途径上游片段是由编码glucose-6-phosphate1-dehydrogenase的ZM4-ZMf基因片段ZMO0367,序列号为SEQ ID NO:3和编码6-phosphogluconolactonase的ZM4-pgl基因片段ZMO1478,序列号为SEQ ID NO:4组成,而下游片段则由编码6-phosphogluconate dehydratase的ZM4-edd基因片段ZMO0368,序列号为SEQ ID NO:1和编码2-dehydro-3-deoxyphosphogluconate aldolase的ZM4-eda基因片段ZMO0997,序列号为SEQ ID NO:2组成。
4.权利要求3所述的方法,其特征是具体步骤如下:
(1)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED下游途径基因片段ZMO0368为模板设计引物z368-F/z368-R(引物z368-F含启动子BBa_J23119),PCR扩增获得由启动子BBa_J23119控制的ZMO0368,以引物z997-F/z997-R扩增来自运动单胞菌ZM4的ED下游途径另一个基因片段ZMO0997;
(2)以运动单胞菌Z.mobilis ZM4的ED上游途径基因片段ZMO0367为模板设计引物z367-F/z367-R,引物z367-F含BBa_J23118;获得分别由启动子BBa_J23118控制的ZMO0367,以引物z1487-F/z1487-R扩增来自运动单胞菌ZM4的ED上游途径的另一个基因片段ZMO1487;
(3)采用融合PCR方法将基因片段ZMO0368,ZMO0997和pUCxer质粒上带有dif位点的庆大霉素抗性片段整合成一个BBa_J23119启动子控制下的ZMO0368-ZMO0997-dif-Xer-dif操纵子片段,通过ack-pta-F/ack-pta-R同源臂引物扩增该整合片段,获得ED下游途径突变盒片段,将ED下游途径突变盒片段电转化进入已诱导重组酶的E.coli LA09感受态中,通过庆大霉素抗性筛选,获得同源重组阳性转化子E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997);
(4)采用融合PCR方法基因片段ZMO0367,ZMO1487和pUCxer质粒上带dif位点的庆大霉素抗性片段整合成由BBa_J23118启动子控制的ZMO0367-ZMO1487-dif-Xer-dif操纵子片段,然后用ldh-F/ldh-R同源臂引物扩增该片段,获得ED上游途径突变盒片段,将该片段电转化到E.coli LA09ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997)感受态获得同源重组阳性转化子E.coliLA09ΔldhA::(BBa_J23118::ZMO0367-ZMO1487)ΔackA-pta::(BBa_J23119::ZMO0368-ZMO0997),构建获得了带有整合型ED上下游途径的异丁醇合成菌株E.coli ED。
5.权利要求1所述的方法,其特征为:对获得的低残糖大肠杆菌异丁醇合成菌株E.coli ED进行发酵试验验证,培养温度为37℃,转速为250rpm条件下培养细菌,当细胞OD600增长到0.6~0.8时,加入0.1~1mM的IPTG进行异丁醇诱导后继续在200rpm和30℃条件下发酵;结果显示当培养基中葡萄糖初始浓度为45g/L,发酵时间为30h,培养基中残糖为0.87g/L,异丁醇产量达到了13.67g/L,比菌株E.coli LA09(8.74g/L)提升了56%。