本发明涉及一种生长激素受体激活剂的制备方法。
背景技术：
生长激素(growthhormone，gh)是由垂体分泌的多肽，经循环系统运送至靶器官上发挥相应的生物效应，由191个氨基酸组成.研究表明，gh对动物的生长发育有着极其重要的作用，同时在免疫、生殖、代谢等方面亦有许多重要生理功能，是动物机体最重要的内分泌激素之一。gh生理作用的发挥主要通过生长激素受体(growthhormonereceptor，ghr)介导。ghr属于典型的i类生长因子受体，由620个氨基酸组成，包括胞外域、跨膜域和胞内域。gh与相应靶细胞的ghr相结合发挥其生理作用，产生相应的生长因子和免疫调节因子，如胰岛素样生长因子(in-sulin-likegrowthfactors-1，igfl)、白介素-6(inter-leukin-6，il6)、白介素-2(interleukin-2，il2)等，胞内信号转导路径主要包括janus激酶(januskianse，jak)-信号传导及转录激活因子(signaltransduc-ersandactivatorsoftranscription，stat)、jak-丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinki-nase，mapk)和jak-细胞外调节蛋白激酶(extra-cellularsignal-regulatedkinases1and2，erkl/2)途径，ghr介导信号转导开启靶基因通过旁分泌和自分泌的方式发挥相应的生理作用。cunningham等首次利用晶体试验证实，-分子gh与两分子的ghr相结合产生二聚体而激活ghr，其结合位点-个为高亲和性的位点(sitel)，一个为低亲和性的位点(site2)。herrington等[81研究表明，gh高亲和性位点先与ghr结合，导致gh发生翻转，再与低亲和性位点相结合形成二聚体，进而启动信号转导。然而近年来研究表明，仅形成二聚体不足以启动信号转导，gh与ghr结合后须经过ghr的旋转才能启动信号转导口。
随着人们对动物产品安全性要求的逐步提高，动物生产中过量使用激素造成的残留问题引起社会广泛关注。外源性的生长激素是被禁止在动物生产中使用的，但gh在动物生长发育过程中具有重要作用，所以研究开发可替代gh的生物制剂尤为重要。本课题组多年来-直致力于gh可替代物的研究，从多个角度研究和开发了ghr激活剂，如使用肽类物质和抗独特型抗体等，都取得了-定的效果。在笔者尝试使用新的方法制备ghr激活剂的过程中，通过查阅文献发现，1991年科学杂志(science)首先报道了生长激素与其受体的晶体结构(gh-ghr)，晶体结构表面-分子gh与两分子ghr结合，当时科学家认为ghr的激活机制是二聚化(即1个gh分子将2个ghr分子招募到-起，形成二聚化的受体gh-(ghr)。
研究发现，部分抗ghr抗体能够使表达有ghr的细胞增殖，但若将抗ghr抗体降解为单价的fab后，其则失去了促进细胞增殖的功能，这再次验证了ghr的激活是通过二聚化完成的。此外，rowlin-son等通过制备-系列的抗ghr抗体，发现部分抗体能够促进有ghr表达的细胞增殖。wan等对-个激活性抗ghr单克隆抗体进行表位作图发现，抗ghr的抗体诱导受体产生相应的构象变化。这-系列研究似乎表明抗ghr抗体能够激活ghr，为此推测抗ghr抗体也能够作为gh的模拟物，但目前国内尚未见相关的研究报道。
技术实现要素：
本发明提出一种生长激素受体激活剂的制备方法。
一种生长激素受体激活剂的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）用含体积分数10％灭活胎牛血清、青霉素100iu/mi.链霉素100iu/ml的rp—mi一1640培养基培养cho～ghr638细胞，培养条件37℃、体积分数5％二氧化碳；
（2）选取6周龄雌性鼠6只，首免以100毫克ghbp与等体积弗氏完全佐剂乳化后免疫balb/c鼠，免疫剂量为50毫克/只)，并以14d为问隔进行加强免疫，剂量与首免相同，不同的是与弗氏不完全佐剂乳化，每次加强免疫后3d采尾静脉血测效价，直至效价达到1：20000以上时，取鼠脾脏细胞与sp2/o融合；
（3）将融合后的细胞分散于96孔细胞培养板中，经含有hat的培养基筛选培养10d后，利用间接elisa筛选阳性克隆，将阳性克隆转移到20孔培养板，扩大培养；
（4）取elisa检测阳性孔上清液500肚l与cho—ghr638(细胞密度为1x104mi.-1)4℃孵育30min，以elisa检测阴性孔同样处理作对照，pbs洗涤细胞3次，洗涤后1000r/min离心10min沉淀细胞并加入fitc标记羊抗鼠igg抗体(二抗)(1：200稀释)，37℃光孵育30min；
（5）然后用pbs洗涤细胞，进行流式细胞仪检测，通过cellquest软件分析流式数据，扩大培养经3次流式检测均为阳性的杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生腹水的方法制备腹水，采用辛酸一饱和硫酸铵法纯化腹水，纯化后的抗体(igo)保存备用；
（6）用无血清rpmi-1640培养基调整细胞密度为1000每毫升在37℃平衡30min；
（7）将fitc—gh(60ng/ml)分别与2，4，6，8，10，12，14，16，18，20ng/ml的未标记gh或纯化的抗ghr抗体混合，并与cho—ghr638细胞4℃共孵育60min，pbs洗涤2次后，将各组细胞分别用500毫升，pbs重悬，并移入流式管中静置后即得。
本发明所述方法制备的生长激素受体激活剂，激活了胞内信号通路蛋白jak2、stat5、erkl／2，表现出生长激素样的活性，这为进一步探索生长激素类似物提供了新的方向。
具体实施方式
实施例1。
一种生长激素受体激活剂的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
（1）用含体积分数10％灭活胎牛血清、青霉素100iu/mi.链霉素100iu/ml的rp—mi一1640培养基培养cho～ghr638细胞，培养条件37℃、体积分数5％二氧化碳；
（2）选取6周龄雌性鼠6只，首免以100毫克ghbp与等体积弗氏完全佐剂乳化后免疫balb/c鼠，免疫剂量为50毫克/只)，并以14d为问隔进行加强免疫，剂量与首免相同，不同的是与弗氏不完全佐剂乳化，每次加强免疫后3d采尾静脉血测效价，直至效价达到1：20000以上时，取鼠脾脏细胞与sp2/o融合；
（3）将融合后的细胞分散于96孔细胞培养板中，经含有hat的培养基筛选培养10d后，利用间接elisa筛选阳性克隆，将阳性克隆转移到20孔培养板，扩大培养；
（4）取elisa检测阳性孔上清液500肚l与cho—ghr638(细胞密度为1x104mi.-1)4℃孵育30min，以elisa检测阴性孔同样处理作对照，pbs洗涤细胞3次，洗涤后1000r/min离心10min沉淀细胞并加入fitc标记羊抗鼠igg抗体(二抗)(1：200稀释)，37℃光孵育30min；
（5）然后用pbs洗涤细胞，进行流式细胞仪检测，通过cellquest软件分析流式数据，扩大培养经3次流式检测均为阳性的杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生腹水的方法制备腹水，采用辛酸一饱和硫酸铵法纯化腹水，纯化后的抗体(igo)保存备用；
（6）用无血清rpmi-1640培养基调整细胞密度为1000每毫升在37℃平衡30min；
（7）将fitc—gh(60ng/ml)分别与2，4，6，8，10，12，14，16，18，20ng/ml的未标记gh或纯化的抗ghr抗体混合，并与cho—ghr638细胞4℃共孵育60min，pbs洗涤2次后，将各组细胞分别用500毫升，pbs重悬，并移入流式管中静置后即得。