本发明涉及考古检测领域，尤其涉及一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为柞蚕丝和桑蚕丝两大类。鉴于桑蚕丝的起源问题一直笼罩在迷雾中，迫切需要一种更科学的方法来鉴定出土的丝织品。蚕丝的常规检测方法主要有傅里叶红外光谱、拉曼光谱、x-射线衍射等，但蚕丝长期处于墓葬或遗址环境中会受到多种因素影响，从而出现蛋白质降解及大分子链断裂等问题，采用传统的一些方法很难检测到丝素蛋白的存在。因此如何采用自然科学的先进手段，建立丝织品微痕检测技术体系，从印痕，残留物，土壤中提取古代丝绸的信息，对研究丝绸的起源至关重要。当前蛋白质检测的先进技术是基于抗体-抗原的westernblotting或elisa法，桑蚕丝素蛋白抗体的制备是该研究的一个关键环节。目前已出现了桑蚕丝素蛋白的多克隆抗体，抗体的特异性取决于抗原分子的决定簇，抗原分子具有很多抗原决定簇，因此免疫动物产生的抗体为多种抗体的混合物，要把这些不同的抗体分开十分困难，同时多克隆抗体存在纯度低、理化性状不均一、与抗原结合特异性不强等问题。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。本发明方法制备的抗体特异性强，且其在应用过程中操作简单快捷，检测准确性高。
本发明的具体技术方案为：一种桑蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
a）称取15g桑蚕丝并将其以1:45-55的浴比添加至去离子水中，加入2.25-3.75g碳酸钠，于90-98℃水浴下恒温脱胶55-65min，结束后调节ph至中性，反复操作多次，将脱胶后的桑蚕丝加入去离子水中浸泡，然后烘干。
b）将450-550ml异辛烷与900-1100ml正辛醇混合，搅拌混匀得到混合油性溶剂，称取0.3-0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3-0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于450-550ml前述混合油性溶剂中。
与现有方法相比，本发明采用双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠和聚乙烯基吡啶季铵盐复配，这两种成分能相互作用，提升蛋白质的提取率，同时对蛋白质结构没有损害。
c）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到700-800ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.5-9.7，得到碳酸盐缓冲溶液；取步骤a）中烘干后的桑蚕丝5g溶于45-55ml碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入至45-55ml步骤b）所得的混合油性溶剂中，混合均匀，再搅拌处理，然后离心处理，取上层溶液备用。
d）称取29.2g氯化钠，加入到450-550ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.4-9.5，取步骤c）所得上层溶液，按体积比0.9-1.1:1与氯化钠溶液混合，混匀后搅拌处理，然后离心处理，取下层水相。
本发明的步骤c）和步骤d)前后两次进行混匀离心，使蛋白质来回溶解在油相和水相中，对提高蛋白质的提取率有显著作用。
e）取步骤d）所得下层水相，倒入透析袋中进行透析，透析后对透析袋中剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白完全抗原，备用。
f）用生理盐水溶解步骤e）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原，控制浓度为1-2mg/ml，然后与quickantibody-rabbit8w按体积比0.9-1.1:1混合，制得抗原佐剂混合溶液；选取2只大白兔进行初次免疫，用抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。
g）用0.4-0.6mg步骤e）所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗，将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10ml，将脾脏碾碎过筛网，然后用1640培养液悬浮，在10000-14000rpm下离心4-6min，移除上清液，再洗涤一次，得到细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液，备用，在细胞融合试验前5天，另行取骨髓瘤细胞进行传代培养。
h）取步骤g）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按1.8-2.2:1的数量比混匀，加培养液后在10000-14000rpm下离心4-6min，弃上清液，在35-39℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在10000-14000rpm下离心，弃上清后将细胞用20%hat选择培养液悬浮。
i）步骤h）中细胞融合10天后，用间接elisa法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用hat培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。
j）ph7.4的pbs溶液的制备。
k）对步骤i）中所得兔单克隆抗体进行纯化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为58-62ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液清洗柱子，清洗的流速为115-125ml/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液进行洗脱；洗脱完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs溶液洗涤多肽柱，获得纯化后的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体，在1-5℃下储存备用。
本发明采用的纯化方法与现有方法相比，具有操作简单快捷，所得抗体纯度高，生物活性好的优点。
作为优选，步骤a)中，将脱胶后的桑蚕丝加入至180-220ml去离子水中浸泡1.5-2.5h，然后在55-65℃下烘干。
作为优选，步骤c）和步骤d）中，搅拌时间为4-6min，离心速率为11000-13000r/min，离心时间为8-12min。
作为优选，步骤e）中，透析袋的分子截留量为8000，透析过程中每5-7h换一次水，透析2-3天。
作为优选，步骤f）中，所述大白兔为14-16周龄。
作为优选，步骤f）中，初次免疫和加强免疫时抗原佐剂混合溶液的注射量为100μl。
作为优选，步骤j）中，所述ph7.4的pbs溶液的制备方法为：称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4。
上述方法制得的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体在文物样品质地鉴定中的应用，方法如下：
取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度在酶标板中包被11-13h，每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35-39℃下封闭110-130min；每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将桑蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl桑蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35-39℃下孵育50-70min，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μl的辣根过氧化酶标二抗，35-39℃下孵育55-65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，9-11min后，加入100μl，2mol/l的h2so4终止反应；用酶标仪测定od450nm，当od值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有桑蚕丝；根据此标准，可以判断桑蚕丝素蛋白的存在。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1、采用桑蚕丝直接提取的丝素蛋白制备出来的单克隆抗体具有很强的特异性，能够与桑蚕丝素蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度很高。
2、采用桑蚕丝素蛋白制备出来的单克隆抗体能够对古代丝制品中的桑蚕丝素蛋白分子做出检测，为中国早期墓葬中丝织物的检测提供了一种敏感、特异、快捷的辨识方法，为探究桑蚕丝的起源问题提供了一种科学的方法。
3、采用双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠和聚乙烯基吡啶季铵盐复配，这两种成分能相互作用，提升蛋白质的提取率，同时对蛋白质结构没有损害。
4、本发明的步骤c）和步骤d)前后两次进行混匀离心，使蛋白质来回溶解在油相和水相中，对提高蛋白质的提取率有显著作用。
5、采用的抗体纯化方法操作简单快捷，所得抗体纯度高，生物活性好的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施方式一
a）称取15g桑蚕丝以1:50的浴比加入去离子水中，加入2.25g碳酸钠，于95℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入醋酸调节ph至中性，反复操作2次。脱胶后的桑蚕丝加入至200ml去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b）将500ml异辛烷和1000ml正辛醇混合，搅拌混匀备用，称取0.3mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.3mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于500ml前述混合溶液中。
c）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.6，取步骤a）中烘干后的蚕丝5g溶于50ml碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入50ml步骤b）中所配得的溶液，混合均匀。混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取上层溶液备用。
d）称取29.2g氯化钠，加入到500ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.5，取c）中所得离心后的上层溶液，按体积比1:1与氯化钠溶液混合，混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取下层水相。
e）取步骤d）中获得的水相，倒入分子截留量为8000的透析袋中，每六小时换一次水，透析两天，对剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白粉末作为完全抗原备用。
f）用适量的生理盐水溶解步骤d）中所得桑蚕丝素蛋白粉，稀释为1mg/ml，然后与quickantibody-rabbit8w按体积比1:1混合。选取2只大白兔（14-16周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μl，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。
g）用0.5mg步骤e）中所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10ml，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000rpm下离心5min。移除上清，再洗涤一次,得少量细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液。在细胞融合试验前5天，另取骨髓瘤细胞进行传代培养。
h）取步骤g）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000rpm下离心5min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000rpm下离心，弃上清后将细胞用20%hat选择培养液悬浮。
i）步骤h）中细胞融合10天后，用间接elisa法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用hat培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。
j）称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
k）对步骤i）中所得单抗进行纯化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速为120ml/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs进行洗脱；洗脱完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗涤多肽柱，获得纯化后的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4℃下储存备用。
l）特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度在酶标板中包被2h，每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在37℃下封闭120min；每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将桑蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl桑蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，37℃下孵育60min，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μl的辣根过氧化酶标二抗，37℃下孵育60min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，10min后，加入100μl，2mol/l的h2so4终止反应；用酶标仪测定od450nm，当od值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有桑蚕丝；根据此标准，可以判断桑蚕丝素蛋白的存在。
实施方式二
a）称取15g桑蚕丝以1:50的浴比加入去离子水中，加入3g碳酸钠，于95℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入醋酸调节ph至中性，反复操作2次。脱胶后的桑蚕丝加入至200ml去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b）将500ml异辛烷和1000ml正辛醇混合，搅拌混匀备用，称取0.4mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.4mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于500ml前述混合溶液中。
c）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.6，取步骤a）中烘干后的蚕丝5g溶于50ml碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入50ml步骤b）中所配得的溶液，混合均匀。混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取上层溶液备用。
d）称取29.2g氯化钠，加入到500ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.5，取c）中所得离心后的上层溶液，按体积比1:1与氯化钠溶液混合，混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取下层水相。
e）取步骤d）中获得的水相，倒入分子截留量为8000的透析袋中，每六小时换一次水，透析两天，对剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白粉末作为完全抗原备用。
f）用适量的生理盐水溶解步骤d）中所得桑蚕丝素蛋白粉，稀释为1.5mg/ml，然后与quickantibody-rabbit8w按体积比1:1混合。选取2只大白兔（14-16周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μl，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。
g）用0.5mg步骤e）中所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10ml，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000rpm下离心5min。移除上清，再洗涤一次,得少量细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液。在细胞融合试验前5天，另取骨髓瘤细胞进行传代培养。
h）取步骤g）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000rpm下离心5min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000rpm下离心，弃上清后将细胞用20%hat选择培养液悬浮。
i）步骤h）中细胞融合10天后，用间接elisa法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用hat培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。
j）称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
k）对步骤i）中所得单抗进行纯化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速为120ml/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs进行洗脱；洗脱完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗涤多肽柱，获得纯化后的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4℃下储存备用。
l）特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度在酶标板中包被11h，每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在35-39℃下封闭110-130min；每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将桑蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl桑蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，35℃下孵育70min，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μl的辣根过氧化酶标二抗，35℃下孵育65min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，9min后，加入100μl，2mol/l的h2so4终止反应；用酶标仪测定od450nm，当od值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有桑蚕丝；根据此标准，可以判断桑蚕丝素蛋白的存在。
实施方式三
a）称取15g桑蚕丝以1:50的浴比加入去离子水中，加入3.75g碳酸钠，于95℃水浴下恒温60min进行脱胶，水浴结束后加入醋酸调节ph至中性，反复操作2次。脱胶后的桑蚕丝加入至200ml去离子水中浸泡2h，然后在60℃下烘干。
b.将500ml异辛烷和1000ml正辛醇混合，搅拌混匀备用，称取0.5mol的双（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠，0.5mol的聚乙烯基吡啶季铵盐溶于500ml前述混合溶液中。
c）称取1.5g碳酸钠和2.9g碳酸氢钠，加入到800ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.6，取步骤a）中烘干后的蚕丝5g溶于50ml碳酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解后加入50ml步骤b）中所配得的溶液，混合均匀。混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取上层溶液备用。
d）称取29.2g氯化钠，加入到500ml去离子水中，搅拌溶解后定容至1000ml，调节ph至9.5，取c）中所得离心后的上层溶液，按体积比1:1与氯化钠溶液混合，混匀后的溶液用磁力搅拌器搅拌5min，然后在离心机上以12000r/min的速度离心10min，离心后取下层水相。
e）取步骤d）中获得的水相，倒入分子截留量为8000的透析袋中，每六小时换一次水，透析两天，对剩余溶液进行冷冻干燥，对干燥后获得的样品进行研磨，得到桑蚕丝素蛋白粉末作为完全抗原备用。
f）用适量的生理盐水溶解步骤d）中所得桑蚕丝素蛋白粉，稀释为2mg/ml，然后与quickantibody-rabbit8w按体积比1:1混合。选取2只大白兔（14-16周龄）进行初次免疫。用上述制得的抗原佐剂混合溶液对每只兔的后大腿和皮下进行多点注射，注射量为100μl。在完成初次免疫后的第3周使用同样的抗原佐剂混合溶液对兔子进行皮下多点注射，注射量为100μl，进行加强免疫；第5周选取免疫后效价相对较高的大白兔进入单克隆抗体制备。
g）用0.5mg步骤e）中所得桑蚕丝素蛋白完全抗原对选取的大兔进行静脉注射，7天后在无菌条件下取出脾脏，在无菌培养皿中将脾脏清理干净，用1640培养液冲洗。将洗净后的脾脏放入无菌皿中，加入1640培养液10ml，将脾脏碾碎过不锈钢筛网，然后用1640培养液悬浮，在12000rpm下离心5min。移除上清，再洗涤一次,得少量细胞悬液，并将其浓度稀释为含有1×108个脾淋巴细胞的悬液。在细胞融合试验前5天，另取骨髓瘤细胞进行传代培养。
h）取步骤g）培养得到的脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞按2:1的数量比混匀，加培养液后在12000rpm下离心5min,弃上清。在37℃水浴中恒温加热，并缓缓加入聚乙二醇-1500，再加入1640培养液稀释，在12000rpm下离心，弃上清后将细胞用20%hat选择培养液悬浮。
i）步骤h）中细胞融合10天后，用间接elisa法选出分泌抗体呈阳性，抗体分泌能力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，用hat培养基扩大培养后，用有限稀释法在96孔板内进行克隆化，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。利用筛选出的细胞进行大转生产，收集兔单克隆抗体进入纯化阶段。
j）称取0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸氢二钠，8g氯化钠和0.2g氯化钾，加入到800ml去离子水中，然后混合搅拌直到全部溶解，用1000ml的容量瓶进行定容，调节溶液的ph为7.4，得到ph7.4的pbs溶液。
k）对步骤i）中所得单抗进行纯化：用10ml，0.5mol/l的nacl溶液和10ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60ml/h；用30ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs将收集到的兔单克隆抗体稀释，稀释后上样，重复上样一次；用20ml，0.05mol/l，ph7.4的pbs清洗柱子，清洗的流速为120ml/h，使其在280nm处的紫外吸收接近基线；用0.5mol/l的nacl溶液和0.05mol/l，ph7.4的pbs进行洗脱；洗脱完成后用0.05mol/l，ph7.4的pbs洗涤多肽柱，获得纯化后的桑蚕丝素蛋白单克隆抗体，在4℃下储存备用。
l）特异性检测：取待检文物的部分作为检测样品，对检测样品提取蛋白后干燥粉碎；对其用1wt%的牛血清白蛋白溶液配制成1μg/ml的浓度在酶标板中包被13h，每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次；用1wt%的牛血清白蛋白溶液在39℃下封闭110min；每孔用200μl的ph7.4磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，然后将桑蚕丝素蛋白单克隆抗体分别用1wt%的牛血清白蛋白溶液稀释1:240000，1:60000，1：20000，1:10000，1:5000，1:1000，1:200倍，每孔加入100μl桑蚕丝素蛋白单克隆抗体稀释液，39℃下孵育50min，用ph7.4的磷酸盐缓冲溶液洗涤5次；每孔加入100μl的辣根过氧化酶标二抗，39℃下孵育55min，所述二抗采用1wt%的牛血清白蛋白稀释5000倍；最后每孔加入100μl的1wt%的四甲基联苯胺溶液于黑暗处显色，11min后，加入100μl，2mol/l的h2so4终止反应；用酶标仪测定od450nm，当od值达到阳性标准时就可以确定检测样品中含有桑蚕丝；根据此标准，可以判断桑蚕丝素蛋白的存在。
本发明方法中桑蚕丝素蛋白的提取率，可达82%以上。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。