基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用的制作方法

本发明属于微流控技术领域，尤其涉及一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片及其应用。

背景技术：

微流控技术是多学科交叉的科技前沿领域之一，具有尺寸小、效率高、集成度高、分析速度快、价格低廉等一系列特点。液滴微流控是微流控技术的重要分支，微流控液滴系统为单细胞分析提供了一个潜在的工具，利用微流控系统，可对单细胞进行快速分割和高通量平行观察检测。利用微流控液滴进行细胞培养已经是比较成熟的技术，采用特定的微通道设计如捕获阵列、培养小室、微孔阵列来固定微液滴，可以实现在线细胞培养，整个实验过程中细胞的相对位置不会发生变化。基于微流控芯片的液滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年发展起来的高灵敏的核酸检测分析技术，受到广泛重视。ddPCR将含有待测核酸分子的反应体系包入成千上万10^-12-10^-9升的油包水型液滴，根据泊松分布原理，合理控制反应物浓度，绝大多数液滴不含或最多只包含1个待测核酸分子，PCR扩增之后，只有包含待测核酸分子的液滴才能产生荧光信号。对荧光信号呈阳性的液滴逐个计数，即得到样本中待测核酸分子的拷贝数。由于ddPCR是在单分子层面绝对定量待测核酸分子，大大提高了检测的灵敏度和结果的准确性，特别适用于微量核酸的检测和定量分析。

国际市场上，基于液滴数字PCR技术已经研发成功的公司有Bio-Rad、Fluidigm，Life Technoligies和Raindance,其中Bio-Rad公司已经成为数字PCR领域的市场领导者，但其高昂的仪器价格，使得很多实验室望而却步。Bio-Rad的液滴PCR仪从液滴生成，核酸扩增，荧光检测都是不同的仪器操作，从而增加了操作的繁琐性，并且每一步骤都带入了样品转移引起的损耗，降低了集成度，既增加了操作时间，也增加了仪器成本。

技术实现要素：

一方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种液滴捕获芯片，本发明的液滴捕获芯片可有效减少堵塞，可结合海藻胶液滴使用。

一种液滴捕获芯片，其包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通；每个流体微通道的两端分别设有第一入口和第一出口；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口和第二出口，用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述液滴捕获结构为底部设有开口的U型结构，所述液滴进入端位于U型结构的顶部开口处，所述抑制液滴流出端位于U型结构的底部开口处。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述抑制液滴流出端的宽度为10-30μm，所述液滴进入端的宽度为80-120μm。

为对上述技术方案的更进一步改进，所述抑制液滴流出端的宽度为20μm，所述液滴进入端的宽度为110μm。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述流体微通道设有50-200行，每行流体微通道设有50-200个液滴捕获结构。

作为对上述技术方案的进一步改进，相邻两条流体微通道的液滴捕获结构交叉布设，其中，一条流体微通道的液滴捕获结构的抑制液滴流出端与另一条流体微通道的两个液滴捕获结构之间的空隙相对应。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一入口、第一出口、第二入口和第二出口分别通过多支路汇集通道形成第一总入口、第一总出口、第二总入口和第二总出口。

另一方面，本发明还提供了一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片，其中，所述数字PCR芯片包括以上所述的液滴捕获芯片，所述数字PCR芯片还包括液滴生成芯片，所述液滴生成芯片包括液滴生成区、第一进液通道、第二进液通道和出液通道；

所述第一进液通道的一端、第二进液通道的一端和出液通道的一端汇集于所述液滴生成区上，所述第一进液通道的另一端设有第一进液口，所述第二进液通道的另一端设有第二进液口，所述出液通道的另一端与由所述流体微通道经多支路汇集形成的总通道连通。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一进液通道、第二进液通道和出液通道之间的连通采用T型通道结构。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述出液通道包括一段弯曲通道，用于使液滴内的物质充分混合。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述弯曲通道的长度为1mm，宽度为120μm。

再一方面，本发明还提供了一种核酸扩增反应方法，包括：

(1)提供以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片；

(2)分别向所述数字PCR芯片的第一进液口和第二进液口中加入分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体、PCR反应液，所述连续相包含油相，所述分散相和连续相中存在着接触反应后能够使海藻胶单体发生交联的物质；

分散相和连续相分别流经第一进液通道、第二进液通道，接触后在液滴生成区生成海藻胶液滴，随后海藻胶液滴经流体微通道被捕获至液滴捕获腔室；

(3)将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下，进行原位扩增反应。

所述步骤(3)中，将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下可通过多种方式实现，例如在基于海藻胶液滴的数字PCR芯片下放置温度控制的模块，相当于一个加热板，芯片在加热板上，通过控制加热板的温度实现原位扩增。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述能够使海藻胶单体发生交联的物质为碳酸钙纳米颗粒和乙酸，其中，碳酸钙纳米颗粒包含在分散相中，乙酸包含在连续相中。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述油相包含油和表面活性剂。优选地，所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。所述表面活性剂选择---中的至少一种。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述分散相还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。更优选地，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺。K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用。最优选地，所述水性组分中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

又一方面，本发明还提供了以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片在核酸扩增反应中的应用。

又一方面，本发明还提供了海藻胶液滴在液滴数字PCR中的应用。

以上所述的海藻胶液滴包含海藻胶微球以及包围所述海藻胶微球的油性组分；所述海藻胶微球包括由海藻胶单体交联形成的海藻胶骨架以及分散在海藻胶骨架内的水性组分。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述水性组分包含一个或更少的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的溶剂。

在一个典型的实施方式中，聚合酶链式反应的溶剂包括扩增缓冲液、4种dNTP混合物、引物、DNA聚合酶、Mg²⁺和双蒸水。

作为对上述技术方案的更进一步改进，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。更优选地，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺。K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用。最优选地，所述水性组分中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述油性组分包含油和表面活性剂，优选地，所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种；所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述海藻胶液滴的尺寸大小为10-200μm。

以上所述的海藻胶液滴的生成方法，包括：

1)提供分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体、PCR反应液，所述连续相为油相，所述分散相和连续相中存在着接触反应后能够使海藻胶单体发生交联的物质；

2)将步骤1)中的分散相和连续相相互汇合后，生成海藻胶液滴。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中，将分散相和连续相通过流动聚焦法或T型通道法生成海藻胶液滴。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述能够使海藻胶单体发生交联的物质为碳酸钙纳米颗粒和乙酸，其中，碳酸钙纳米颗粒包含在分散相中，乙酸包含在连续相中。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述油相包含油和表面活性剂。优选地，所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述分散相还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。更优选地，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺。K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用。最优选地，所述水性组分中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

海藻胶液滴中由于添加使用了海藻胶，使得液滴的稳定性更好，不会发生融合，而且海藻胶的存在不会影响PCR反应的扩增效率，因此适用于液滴数字PCR。特别是结合以上所述的液滴捕获芯片及数字PCR芯片用于液滴数字PCR，可进一步提高检测效率及准确性。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1)本发明使用了海藻胶液滴，海藻胶液滴通过引入海藻胶，使得液滴的稳定性更好，液滴之间不会发生融合，尤其适用于数字液滴PCR，可提高PCR的检测效率以及检测结果的稳定性和准确性；

2)本发明的数字PCR芯片具有U型筛子结构，数字PCR芯片能够很好的捕获海藻胶液滴，捕获效率高并且通道不易堵塞。液滴被捕获后位置固定，相互之间不受干扰，可以实现原位扩增和检测；

3)本发明的核酸扩增反应方法可以实现高通量、高灵敏的检测，使用本发明的数字PCR芯片可以实现高通量液滴的捕获，并且每个液滴都是一个反应器，反应体积小可以提高反应效率，检测更灵敏。

附图说明

图1为本发明基于海藻胶液滴的数字PCR芯片的结构示意图；

图2为图1中A处的放大图；

图3为本发明实施例3中明场和暗场拍摄的液滴图片；

图4为海藻胶液滴在流体微通道中的流动效果图。

具体实施方式

本发明的实施例提供了一种海藻胶液滴，其包含海藻胶微球以及包围所述海藻胶微球的油性组分；所述海藻胶微球包括由海藻胶单体交联形成的海藻胶骨架以及分散在海藻胶骨架内的水性组分。

其中，海藻胶骨架是指海藻胶单体遇阳离子如钙离子、锌离子等离子交联形成的骨架结构，通常海藻胶骨架包含海藻胶外层以及位于海藻胶外层内侧的具有孔隙结构的不规则海藻胶交联结构，水性组分分散在孔隙结构中。在一个典型的实施方式中，海藻胶层为钙离子与海藻胶单体形成的分子间交联结构。

所述海藻胶液滴尤其适用于液滴数字PCR中，海藻胶的引入对PCR无不良影响，在一个典型的实施方式中，所述水性组分包含一个或更少的靶核酸和足以进行聚合酶链式反应的溶剂。

进一步地，为了消除海藻胶对PCR的抑制作用，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。在一个实施例中，所述水性组分包含K⁺和Na⁺，其中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

所述油性组分包含油和表面活性剂，表面活性剂的加入可进一步提高液滴的稳定性。目前，为了获取较为稳定的液滴，通常需要采用进口的较为昂贵的表面活性剂，而本发明别出心裁，通过引入海藻胶制得的海藻胶液滴，采用普通廉价的表面活性剂可得到更为稳定的液滴，降低了成本。其中，所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种；所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。进一步地，所述海藻胶液滴的尺寸大小为10-200μm。

本发明的实施例还提供了以上所述的海藻胶液滴的生成方法，包括：

1)提供分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体、PCR反应液，所述连续相为油相，所述分散相和连续相中存在着接触反应后能够使海藻胶单体发生交联的物质；

2)将步骤1)中的分散相和连续相相互汇合后，生成海藻胶液滴。

具体地，所述步骤2)中，将分散相和连续相通过流动聚焦法或T型通道法生成海藻胶液滴。

为了使海藻胶单体在分散相和连续相接触后产生交联以形成海藻胶液滴，在一个典型的实施方式中，分散相中包含碳酸钙纳米颗粒，连续相为含乙酸的矿物油，当碳酸钙纳米颗粒遇到含乙酸的矿物油时会释放钙离子，引发海藻胶凝固成海藻胶微球(即微滴)。

进一步地，为了消除海藻胶对PCR的抑制作用，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。在一个实施例中，所述水性组分包含K⁺和Na⁺，其中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

所述油性组分包含油和表面活性剂，其中，所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种；所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。

海藻胶液滴生成的原理如下：原料包括分散相和连续相，连续相是包含有表面活性剂的油，如矿物油，分散相包含有海藻胶的单体、纳米碳酸钙和相关PCR反应液，形成的是连续相包裹分散相的微滴，所以应该是海藻胶单体、纳米碳酸钙及PCR反应液被连续相的油包裹在里面。油相里我们加了乙酸，乙酸会和纳米碳酸钙发生反应，产生钙离子，钙离子使海藻胶单体交联，海藻胶固化，最后形成海藻胶微球，微球里面包裹有PCR反应液，外面有油相包裹。

本发明的实施例还提供了以上所述的海藻胶液滴在液滴数字PCR中的应用。

本发明的实施例还提供了液滴捕获芯片，所述液滴捕获芯片可用于捕获以上所述的海藻胶液滴，其包括多个平行排列的流体微通道，其中，沿着所述流体微通道间隔地形成多个液滴捕获结构，所述液滴捕获结构包括液滴进入端以及抑制液滴流出端，抑制液滴流出端与相邻的流体微通道相连通；每个流体微通道的两端分别设有第一入口和第一出口；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口和第二出口，用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构。

进一步地，所述液滴捕获结构为底部设有开口的U型结构，所述液滴进入端位于U型结构的顶部开口处，所述抑制液滴流出端位于U型结构的底部开口处。在一个典型的实施方式中，所述抑制液滴流出端的宽度为20μm，所述液滴进入端的宽度为110μm；所述流体微通道设有62行，每行流体微通道设有95个液滴捕获结构。

在一个实施例中，相邻两条流体微通道的液滴捕获结构交叉布设，其中，一条流体微通道的液滴捕获结构的抑制液滴流出端与另一条流体微通道的两个液滴捕获结构之间的空隙相对应。

在一个实施例中，所述第二入口设于与所述液滴进入端相对的一侧；所述第二入口的数量与邻近的一行液滴捕获结构的数量相同，且每个第二入口与邻近的液滴捕获结构相适应；

所述第二出口的数量与邻近的一行液滴捕获结构的数量相同，且每个第二出口与邻近的液滴捕获结构相适应。

本发明的实施例还提供了一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片，其中，所述数字PCR芯片包括以上所述的液滴捕获芯片，所述数字PCR芯片还包括液滴生成芯片，所述液滴生成芯片包括液滴生成区、第一进液通道、第二进液通道和出液通道；

所述第一进液通道的一端、第二进液通道的一端和出液通道的一端汇集于所述液滴生成区上，所述第一进液通道的另一端设有第一进液口，所述第二进液通道的另一端设有第二进液口，所述出液通道的另一端与由所述流体微通道经多支路汇集形成的总通道连通。。

为了便于制备海藻胶液滴，进一步地，所述第一进液通道、第二进液通道和出液通道之间的连通采用T型通道结构。

为了便于使所述液滴生成区生成的液滴内的物质更好地混合，缩小芯片的体积，所述出液通道包括一段弯曲通道。具体地，弯曲通道的长度为---，宽度为---，此时可在较短的时间内保证良好的混合效果。

本发明的实施例还提供一种核酸扩增反应方法，包括：

(1)提供以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片；

(2)分别向所述数字PCR芯片的第一进液口和第二进液口中加入分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体、PCR反应液，所述连续相包含油相，所述分散相和连续相中存在着接触反应后能够使海藻胶单体发生交联的物质；

分散相和连续相分别流经第一进液通道、第二进液通道，接触后在液滴生成区生成海藻胶液滴，随后海藻胶液滴经流体微通道被捕获至液滴捕获腔室；

(3)将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下，进行原位扩增反应。

具体地，所述步骤(3)中，将海藻胶液滴控制在适合PCR反应的温度下可通过多种方式实现，例如在基于海藻胶液滴的数字PCR芯片下放置温度控制的模块，相当于一个加热板，芯片在加热板上，通过控制加热板的温度实现原位扩增。为了使海藻胶单体在分散相和连续相接触后产生交联以形成海藻胶液滴，在一个典型的实施方式中，分散相中包含碳酸钙纳米颗粒，连续相为含乙酸的矿物油，当碳酸钙纳米颗粒遇到含乙酸的矿物油时会释放钙离子，引发海藻胶凝固成海藻胶微球(即微滴)。

进一步地，为了消除海藻胶对PCR的抑制作用，所述水性组分还包含K⁺和Na⁺中的至少一种。在一个实施例中，所述水性组分包含K⁺和Na⁺，其中，K⁺的浓度为7mM，Na⁺的浓度为75mM，K⁺和Na⁺可去除海藻胶对PCR的抑制作用，在此浓度值时的K⁺和Na⁺在去除海藻胶对PCR的抑制作用方面效果最佳。

所述油性组分包含油和表面活性剂，其中，所述表面活性剂选自span80、tween20中的至少一种；所述油选自矿物油、氟化硅油中的至少一种。本发明的实施例还提供了以上所述的海藻胶液滴在液滴数字PCR中的应用。

本发明的实施例还还提供了以上所述的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片在核酸扩增反应中的应用。

综上，该发明提出了一种全集成的基于海藻胶的数字PCR芯片，可以完成从液滴生成到捕获以及检测的全过程。并且引入海藻胶，海藻胶凝固后，海藻胶液滴稳定、不会发生融合并且不会影响PCR的扩增效率。该方法可以应用到血液中循环肿瘤DNA的检测以及其他相关生物、医学的应用，由于海藻胶的引入，可以进一步扩展应用到单细胞分析等。

本发明的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片的制备过程可以采用软复制的过程，首先在硅片上用SU-8光刻胶做出图案，这些结构稍后会被做成微通道、进液口和出液口。用硅片和SU-8光刻胶作为模板，浇注PDMS，加热固化，接下PDMS，将PDMS与带有一薄层PDMS的玻璃进行封接，得到本发明的数字PCR芯片。也可以用玻璃或者塑料通过注塑或、开模或者压印的方法来产生本发明的数字PCR芯片。

通过控制数字PCR芯片的压力和芯片结构的尺寸，可以生成不同尺寸的液滴，液滴尺寸范围可以在10-200um范围内。液滴捕获情况如图3所示，可以看出我们设计的结构可以实现接近100％的捕获，基本上每一个位置都可以捕获到一个液滴。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

液滴捕获芯片

如图1所示，一种液滴捕获芯片1，其包括多个平行排列的流体微通道11，其中，沿着所述流体微通道11间隔地形成多个液滴捕获结构12，所述液滴捕获结构12包括液滴进入端121以及抑制液滴流出端122，抑制液滴流出端122与相邻的流体微通道相连通；为了便于控制，所有液滴捕获结构12的大小、朝向均相同。每个流体微通道11的两端分别设有第一入口13和第一出口14；液滴从第一入口13进入流体微通道11，并在压力的作用下，从左向右移动；垂直于流体微通道的两侧分别设有多个并行排列的第二入口15和第二出口16，第二入口15和第二出口16用于施加垂直于流体微通道的方向上的压力以允许液滴进入液滴捕获结构；具体地，第二入口15设于与所述液滴进入端121相对的一侧，以便于从第二入口15施加压力使液滴进入U型结构内。进一步地，为了便于控制，第一入口13、第一出口14、第二入口15和第二出口16分别通过多支路汇集通道形成第一总入口130、第一总出口140、第二总入口150和第二总出口160。

进一步地，所述第二入口15的数量与邻近的一行液滴捕获结构的数量相同，且每个第二入口15与邻近的液滴捕获结构12相适应，所述第二出口16的数量与邻近的一行液滴捕获结构的数量相同，且每个第二出口16与邻近的液滴捕获结构12相适应，以利于更好地将液滴推入U型结构内。

如图2所示，所述液滴捕获结构12为底部设有开口的U型结构，所述液滴进入端121位于U型结构的顶部开口处，所述抑制液滴流出端122位于U型结构的底部开口处；

在本实施例中，所述抑制液滴流出端122的宽度为20μm，所述液滴进入端121的宽度为110μm；所述流体微通道11设有62行，每行流体微通道设有95个液滴捕获结构。相邻两条流体微通道11的液滴捕获结构交叉布设，其中，一条流体微通道的液滴捕获结构12的抑制液滴流出端122与另一条流体微通道的两个液滴捕获结构12之间的空隙相对应123。液滴进入液滴捕获芯片1后，首先是横排排列的，纵向的第二入口15和第二出口16是堵住的，液滴横向填满流体微通道11后，最右侧的第一出口14堵住，下方的第二入口15进连续相，上方的第二出口16打开，液滴会朝着纵向的方向移动，而被卡在像筛子一样的U型结构内，实现液滴的捕获。

为了提高效率减少堵塞，我们施加了连续的垂直于U形结构的压力。从左侧部分生成的液滴会从左向右连续移动，而我们实现了了纵向的压力保证每一个液滴都被推入捕获结构。这种结构保证了液滴的捕获率，多余的液滴从右侧的出口流出。

基于海藻胶液滴的数字PCR芯片

如图1所示，一种基于海藻胶液滴的数字PCR芯片，包括本实施例中所述的液滴捕获芯片1，所述数字PCR芯片还包括液滴生成芯片2，所述液滴生成芯片2包括液滴生成区21、第一进液通道22、第二进液通道23和出液通道24；

所述第一进液通道22的一端、第二进液通道23的一端和出液通道24的一端汇集于所述液滴生成区23上，所述第一进液通道22的另一端设有第一进液口221，所述第二进液通道23的另一端设有第二进液口231，所述出液通道24的另一端与由所述流体微通道经多支路汇集形成的总通道连通。在本实施例中，液滴生成芯片2还设有备用的第三进液通道25，第三进液通道25的一端汇集于所述液滴生成区23上，其另一端设有第三进液口251。

在本实施例中，第一进液通道22、第二进液通道23和出液通道24之间的连通采用T型通道结构。

进一步地，为了便于使所述液滴生成区生成的液滴内的物质更好地混合，缩小芯片的体积，出液通道24包括一段弯曲通道241；具体地，弯曲通道241的长度为1mm，宽度为120μm，此时可在较短的时间内保证良好的混合效果。

实施例2

核酸扩增反应方法

一种核酸扩增反应方法，包括：

(1)提供实施例2中的基于海藻胶液滴的数字PCR芯片；

(2)分别向所述数字PCR芯片的第一进液口和第二进液口中加入分散相和连续相，所述分散相包含海藻胶单体(2wt％)、PCR反应液、碳酸钙纳米颗粒(40mmol/L)、KCl(7mmol/L)和NaCl(75mmol/L)，所述连续相为含有2μL/mL乙酸、2.5％span 80表面活性剂的矿物油；

分散相和连续相分别流经数字PCR芯片的第一进液通道、第二进液通道，接触后在液滴生成区生成海藻胶液滴，随后海藻胶液滴经流体微通道被捕获至液滴捕获腔室；

(3)在数字PCR芯片下放置温度控制的模块，相当于一个加热板，芯片在加热板上，通过控制加热板的温度实现原位扩增。

H7N9病毒在芯片上进过扩增后拍照的结果如图3所示，该图片是利用荧光倒置显微镜拍摄的，通过显微镜可以采集到我们的荧光信号。检测方法还可以采用激光诱导荧光逐个扫描每一个液滴，因为每一个液滴的位置是固定的，并且可以通过坐标定位每一个液滴，可以用机械方法精确移动芯片，进行检测，这样就可以实现高灵敏的检测。

从图4中可以看出，海藻胶液滴在流体微通道中的稳定性非常好，经过挤压也不会融合。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。