一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法与流程

文档序号:12411352阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法,包括将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞、将原始生殖细胞再次诱导分化为卵母细胞两个步骤,其特征在于:

1)将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞具体为:

①原始细胞准备:分别提取培养了1-2代绿色荧光转移基因小鼠的毛囊干细胞与野生型小鼠成纤维细胞,并将野生型小鼠成纤维细胞采用丝裂霉素C处理,然后将毛囊干细胞与处理后的成纤维细胞按照数量比1:1的比例混合后待用;

②选用DMEM高糖培养基作为原始生殖细胞诱导培养基,并在该培养基内加入以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、以DMEM高糖总体积计40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、80 IU/ml~120 IU/ml白血病抑制因子、15ng/ml~25ng/ml骨形态发生因子、0.20mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸,1.5mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺,0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子, 15ng/ml~25 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子;培养温度35℃-38℃,湿度不低于80%,环境中CO2浓度4%-6%;

③将步骤①获得的待用混合细胞植入步骤②准备的原始生殖细胞诱导培养基,然后将培养基放置在培养箱中,按常规方式进行培养8-10天,即获得诱导分化出的原始生殖细胞;

2)将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞具体为:

①准备卵母细胞诱导培养基:选用DMEM/F12培养基作为卵母细胞诱导培养基,并在培养基内加入以DMEM/F12总质量计12%~18%质量分数的胎牛血清、0.8% ~1.2%质量分数的抗T细胞免疫毒素ITS、1.5%~2.5%质量分数的血清替代物B27、0.8%~1.2%质量分数的青链霉素、以DMEM/F12总体积计1200 IU/ml~1800 IU/ml白细胞抑制因子LIF、40 mIU/ml~60 mIU/ml促卵泡素、8ng/ml~12 ng/ml表皮生长因子、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇;培养温度35℃-38℃,湿度不低于80%,环境中CO2浓度4%-6%;

②将1)中步骤③获得的原始生殖细胞稀释至0.8×106个/L ~1.2×106个/L,然后植入24孔板表面并放置在步骤①获得的卵母细胞诱导培养基中悬浮培养,培养至通过常规方法检测出现尺寸不低于50μm的大细胞,且该类大细胞呈现典型卵母细胞形态、有类似透明带结构出现、表达卵母细胞特异基因,则所述大细胞为所需卵母细胞。

2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法,其特征在于:在步骤1)将毛囊干细胞诱导分化为原始生殖细胞和步骤2)将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞之间还增加有原始生殖细胞专向培养步骤,具体为:将1)中步骤③获得的原始生殖细胞放入专向培养基内进行培养,所述专向培养基具体为:以DMEM高糖培养基作为基础,其内添加以DMEM高糖总质量计8%~12%质量分数的胎牛血清、15ng/ml~25 ng/ml骨形态发生因子、以DMEM高糖总体积计0.20 mmol/L~0.25 mmol/L丙酮酸钠、0.08 mmol/L~0.12 mmol/L非必需氨基酸,1.5 mmol/L~2.5mmol/L L-谷氨酰胺,0.08 mmol/L~0.12 mmol/L β-巯基乙醇, 15ng/ml~25ng/ml表皮生长因子, 30ng/ml~50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子, 30ng/ml~50ng/ml干细胞生长因子;培养时间3-5天,温度35℃-38℃,湿度不低于80%;环境中CO2浓度4%-6%。

3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞体外分化为卵母细胞的方法,其特征在于:将原始生殖细胞诱导分化为卵母细胞的培养周期为20天-25天。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1