本发明属于动物和人类生殖生物工程新技术，主要涉及一种以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法及其模型。
背景技术：
自1997年克隆绵羊多在英国诞生以来，克隆动物研究快速发展，大部分实验动物和家畜克隆业已取得成功，对于生命科学基础研究和特定动物个体的繁育和扩群起到了巨大的推动作用，而且以牛为主的家畜克隆技术开始向产业化应用推进。但是，由于目前克隆的技术水平有限，以细胞核移植为基础的克隆胚胎制作过程复杂，胚胎移植后的克隆动物生产效率仍然十分低，并且每头克隆动物的生产成本高，很难进行大规模推广应用。
另一方面，干细胞技术的完善及其多能性或者全能性特征为动物育种、人类医疗临床应用提供了可能，这也是人工胚胎构建与动物克隆繁育技术模型的基础。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法及其模型。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法，包括以下步骤：
(1)哺乳动物干细胞的准备：哺乳动物干细胞用于人工胚胎的诱导构建，分别通过自制或者商业途径获得；
(2)动物卵子或早期胚胎透明带的准备：在每次进行人工胚胎构建前24小时，根据制作人工胚胎的数量，准备需要数量120％的卵子或者早期胚胎；采集的卵子或早期胚胎以显微操作方式切开透明带并吸出卵细胞质或细胞分裂球，制成空壳的透明带；
(3)人工胚胎构建与细胞分化诱导：
A.干细胞注入卵子透明带：把各种干细胞细胞直接注入到空壳的透明带中诱导人工胚胎，用质量百分比浓度0.5％的胰蛋白酶处理培育的干细胞团，然后用显微操作方式向每个动物卵子或早期胚胎的空壳的透明带内注射40－60个干细胞，把干细胞－透明带复合体集中，并根据不同物种在干细胞培养液中进行体外培养12－24小时，使干细胞继续增值形成60－80个细胞团块，干细胞－透明带复合体的培养条件为5％CO2、5％O2和90％N2；
B.人工胚胎体外诱导培养：将步骤A得到的干细胞－卵子透明带复合体，在5％CO2和95％的空气的培养条件中，在诱导培养液1中的诱导培养12－24小时，在诱导培养液2中的培养分化24－48小时，分化出类似具有内胚团、囊胚腔和营养层细胞组成的囊胚结构干细胞克隆胚胎；
诱导培养液1配方，按体积比
诱导培养液2配方，按体积比
(4)动物克隆繁育：把步骤(3)构建的人工胚胎按照常规技术移植到同期发情的受体动物子宫内，就可以获得具有与干细胞遗传相同的克隆动物后代。
所述哺乳动物包括实验动物、家畜、人类。
所述实验动物是指小鼠、大鼠、兔子、灵长类；家畜指牛、羊、猪、马、鹿。
所述步骤(1)中卵子或者早期胚胎，对于实验动物卵子或早期胚胎可处死采集，家畜卵子可活体采集或使用屠宰母畜卵巢采集。
上述的以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法得到的模型。
本发明的有益效果是：以干细胞为基础来构建哺乳动物人工胚胎，提出动物克隆繁育的新技术模型，这种技术模型具有操作简便、极低生产成本的特点，是未动物育种的重要技术手段，同时具有重要的医学模型应用价值。
附图说明
图1是本发明以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法的流程图。
具体实施方式
下面根据附图对本发明进行详细说明：
本发明包括两个关键技术设计和下述四个实施步骤，两个关键技术设计分别是以干细胞多能性向初期胚胎的分化能力应用、构建的干细胞-卵子透明带复合体的早期胚胎分化诱导。主要四个技术步骤是干细胞的准备、动物卵子或早期胚胎透明带的准备、人工胚胎构建与细胞分化诱导、动物克隆繁育。
本发明利用干细胞的多能性或全能性特征，以哺乳动物、包括人类在内的动物卵子透明带或者相当于透明带的人工合成结构人工胚胎构建的基础干细胞受体结构，置入干细胞后在体外条件下使其诱导分化成哺乳动物着床前胚胎结构(8cell stage-Morula stage and Blastocyst stage)。三种性质干细胞可用于人工胚胎的诱导构建：一种是胚胎干细胞(Embryonic SC)，第二种是早期胚胎的上层胚胎干细胞(Epiblast SC)，第三种是来自成体组织的体细胞干细胞iPS(Somatic SC-iPS)。为了对干细胞在构建人工胚胎过程中的细胞分化进行监测，使用的干细胞中带有标识细胞多能性或全能性Oct-4、Sox2或Nanog基因连接的绿色蛋白GFP。但是在动物育种产业或者人类临床应用中不能使用这种荧光标记。
关于各种哺乳动物包括人类在内的动物干细胞建立技术不包括在本专利发明内容。
如图1所示，本发明包括下述步骤：
(1)哺乳动物干细胞的准备：哺乳动物干细胞用于人工胚胎的诱导构建，分别通过自制或者商业途径获得；
(2)动物卵子或早期胚胎透明带的准备：在每次进行人工胚胎构建前24小时，根据制作人工胚胎的数量，准备需要数量120％的卵子或者早期胚胎；采集的卵子或早期胚胎以显微操作方式切开透明带并吸出卵细胞质或细胞分裂球，制成空壳的透明带；
(3)人工胚胎构建与细胞分化诱导：
A.干细胞注入卵子透明带：把各种干细胞细胞直接注入到空壳的透明带中诱导人工胚胎，用(w:w)0.5％的胰蛋白酶处理培育的干细胞团，然后用显微操作方式向每个动物卵子或早期胚胎的空壳的透明带内注射40－60个干细胞，把干细胞－透明带复合体集中，并根据不同物种在干细胞培养液中进行体外培养12－24小时，使干细胞继续增值形成60－80个细胞团块，干细胞－透明带复合体的培养条件为5％CO2、5％O2和90％N2。
B.人工胚胎体外诱导培养：将步骤A得到的干细胞－卵子透明带复合体，在5％CO2和95％的空气的培养条件中，在诱导培养液1中的诱导培养12－24小时，在诱导培养液2中的培养分化24－48小时，分化出类似具有内胚团、囊胚腔和营养层细胞组成的囊胚结构干细胞克隆胚胎；
诱导培养液1配方，按体积比
诱导培养液2配方，按体积比
(4)动物克隆繁育：把步骤(3)构建的人工胚胎按照常规技术(非手术子宫移植)移植到同期发情的受体动物子宫内，就可以获得具有与干细胞遗传相同的克隆动物后代。
所述哺乳动物包括实验动物、家畜、人类。
所述实验动物是指小鼠、大鼠、兔子、灵长类；家畜指牛、羊、猪、马、鹿。
所述步骤(1)中卵子或者早期胚胎，对于实验动物卵子或早期胚胎可处死采集，家畜卵子可活体采集或使用屠宰母畜卵巢采集。
上述以干细胞为基础的哺乳动物人工胚胎构建-动物克隆繁育的方法得到的模型
实施例1
马干细胞－人工胚胎构建：
1)干细胞的准备：与干细胞系的建立相同，首先在培养干细胞前一周制成经分裂停止处理的单层营养细胞层(马32－34天胚胎成纤维细胞)。营养细胞的培养条件为5％CO2和95％的空气，培养液的组成为STO加20％血清。取8000－10000个经传代16次的冷冻保存马胚胎干细胞，解冻后用干细胞培养液离心处理后置入2－3个4孔培养板，使其增殖3－4天，并形成多个500－800个细胞组成的干细胞团。该干细胞系为来自胚胎的干细胞(Embryonic SC)，没有携带任何可供干细胞分化标记的导入基因。
2)马卵子透明带的准备：在干细胞注入透明带前24小时，根据制作50个克隆胚胎的数量，用屠宰场废弃马卵巢收集70枚马卵子。采集的马卵子以显微操作方式切开透明带并吸出卵细胞质，制成70个空透明带。
3)干细胞注入透明带：可把细胞直接注入到空壳的透明带中诱导克隆胚胎。干细胞的注入方式是当干细胞形成500－800的细胞团，用0.5％的胰蛋白酶处理后分离出干细胞团，然后用显微操作方式向每个动物卵子或早期胚胎的空透明带内注射40－60个干细胞或干细胞团。合计成功组合46个干细胞－卵子透明带复合体，注射结束后把干细胞－透明带复合体集中，并进行体外培养。
4)干细胞－卵子透明带复合体的体外培养及细胞诱导分化：干细胞－卵子透明带复合体的体外培养仍然需要分裂停止处理的单层营养细胞层，培养条件为5％CO2和95％的空气，在诱导培养液1中的培养时间为24小时，在诱导培养液2中的培养时间为72小时，合计诱导培养时间86小时。可分化出类似具有内胚团、囊胚腔和营养层细胞组成的囊胚结构干细胞克隆胚胎32个(32/46，69.6％)。
5)干细胞－人工胚胎的形成和鉴定：由于该干细胞系为来自胚胎的干细胞(Embryonic SC)，没有携带任何可供干细胞分化标记的导入基因，因此利用干细胞特征基因Oct-4特异性免疫荧光染色法，对由干细胞分化来的克隆胚胎进行分析鉴定，其中84％(27/32)显示正常胚胎的细胞功能特征：即分化出的克隆囊胚的内胚团细胞仍显Oct-4基因绿色、而营养层细胞由于分化失去多能性或全能性不显绿色或绿色明显减弱。
实施例2
小鼠干细胞－人工胚胎构建：
1)干细胞的准备：与干细胞系的建立相同，首先在培养干细胞前一周制成经分裂停止处理的单层营养细胞层(小鼠13.5天胚胎成纤维细胞)。营养细胞的培养条件为5％CO2和95％的空气，培养液的组成为STO加20％血清。取8000－10000个经传代24次的冷冻保存小鼠胚胎干细胞，解冻后用干细胞培养液离心处理后置入2－3个4孔培养板，使其增殖3－4天，并形成多个500－800个细胞组成的干细胞团。该干细胞系该干细胞系为来自着床后早期胚胎上层细胞的胚胎干细胞(Epiblast SC)胚胎的干细胞(Embryonic SC)，携带Oct-4基因绿色蛋白，可以直接在显微镜下检测其分化状况。
2)小鼠卵子透明带的准备：在干细胞注入透明带前24小时，根据制作100个克隆胚胎的数量，用激素处理的10只小鼠从输卵管手术采集137枚卵子。采集的小鼠卵子以显微操作方式切开透明带并吸出卵细胞质，制成的114个空透明带。
3)干细胞注入透明带：干细胞的注入方式是当干细胞形成500－800的细胞团，用0.5％的胰蛋白酶处理后分离出干细胞团，然后用显微操作方式向每个动物卵子或早期胚胎的空透明带内注射30－40个干细胞或干细胞团。合计成功组合105个干细胞－卵子透明带复合体，注射结束后把干细胞－透明带复合体集中，并进行体外培养。
4)干细胞－卵子透明带复合体的体外培养及细胞诱导分化：干细胞－卵子透明带复合体的体外培养仍然需要分裂停止处理的单层营养细胞层，培养条件为5％CO2和95％的空气，在诱导培养液1中的培养时间为24小时，在诱导培养液2中的培养时间为24小时，合计诱导培养时间72小时。可分化出类似具有内胚团、囊胚腔和营养层细胞组成的囊胚结构干细胞克隆胚胎87个(87/105，82.9％)。
5)干细胞－人工胚胎的形成和鉴定：对由干细胞分化来的克隆胚胎在荧光显微镜下直接进行观察鉴定，发现其中82％(71/87)的干细胞克隆胚胎显示正常胚胎的细胞功能特征：即分化出的克隆囊胚的内胚团细胞仍显Oct-4基因绿色、而营养层细胞由于分化失去多能性或全能性不显绿色或绿色明显减弱。
实施例3
人类干细胞－人工胚胎构建：
1)干细胞的准备：取8000－10000个经传代24次的冷冻保存人类胚胎干细胞，解冻后用干细胞培养液离心处理后置入2－3个4孔培养板，使其增殖3－4天，并形成多个500－800个细胞组成的干细胞团。
2)人类卵子透明带的准备：在干细胞注入透明带前24小时，根据制作12-15个克隆胚胎的数量，从试管婴儿实验室获得15个废弃的卵子，以显微操作方式切开透明带并吸出卵细胞质，制成的空透明带。
3)干细胞注入透明带：干细胞的注入方式是当干细胞形成500－800的细胞团，用0.5％的胰蛋白酶处理后分离出干细胞团，然后用显微操作方式向每个卵子空透明带内注射30－40个干细胞或干细胞团。合计成功组合12个干细胞－卵子透明带复合体，注射结束后把干细胞－透明带复合体集中，并进行体外培养。
4)干细胞－卵子透明带复合体的体外培养及细胞诱导分化：干细胞－卵子透明带复合体的体外培养仍然需要分裂停止处理的单层营养细胞层，培养条件为5％CO2和95％的空气，在诱导培养液1中的培养时间为24小时，在诱导培养液2中的培养时间为24小时，合计诱导培养时间72小时。
5)干细胞－人工胚胎的形成和鉴定：由于目前没有使用具有荧光标记的人类干细胞系，主要通过形态学方法，把可分化出类似具有内胚团、囊胚腔和营养层细胞组成的复合体判断为干细胞-克隆胚胎8个(8/12，66.7％)。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。