一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法与流程

本发明属于细胞、组织工程技术领域，具体涉及一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法。

背景技术：

大鲵是世界上现存最大最珍贵的两栖动物，是国家二类水生野生保护动物，也是农业产业化和特色农业重点开发品种，已在我国多地养殖并形成一定产量，2012年大鲵养殖量已经突破330万尾。研究表明，人工养殖大鲵的皮肤中含有丰富的Ⅰ型胶原蛋白，约占大鲵皮肤中蛋白质总量的62.89％，该胶原蛋白具有与哺乳动物胶原相似的氨基酸组成和性质，对人体没有排异性，同时具有嫩白、容颜、祛皱的美容功效。大鲵皮肤分泌的黏液含有多种“蛙皮素”，具有较强的抗菌作用，可作为新的抗生素药物来源进行研究开发。大鲵还有超强的再生和自我修复能力，民间常以其皮肤研粉拌桐油治疗火烫伤，促进皮肤再生。因此，大鲵皮肤及其分泌物的研究有着广阔的应用前景。

但是对于大鲵皮肤及其分泌物的研究还存在以下瓶颈：(1)大鲵表皮细胞的培养基组成成分、细胞培养温度等条件尚不明确，需要经过摸索，才能找到适合大鲵表皮细胞生长的培养条件。(2)大鲵表皮特异基因的序列目前还没有，需要根据基因序列的同源性，比较不同已知物种的序列，在同源性高的区域设计多对PCR引物进行摸索，找到能够扩增大鲵表皮特异基因的引物。因此目前关于大鲵皮肤表皮细胞的研究，特别是大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养以及鉴定方法还未见报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，该方法实现了大鲵皮肤表皮细胞的人工培养，为大鲵皮肤的实验研究提供了技术支持。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，包括以下步骤：

(1)取活体大鲵尾部的皮肤组织，放入PBS缓冲液中；

(2)在10min内，将放入PBS缓冲液的皮肤组织表面的粘液刮去，再放入75％酒精中浸泡10s；

(3)用PBS缓冲液清洗6-8次，将皮肤组织剪成直径1mm的组织块，将组织块贴到T25培养瓶中，加入4mL培养液进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液，皮肤组织块贴壁培养6天后进行传代培养，得到大鲵皮肤表皮细胞。

所述的PBS缓冲液为4℃预冷、体积分数60％的添加双抗的PBS缓冲液，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素为500U/mL，链霉素为0.5mg/mL。

所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15％的胎牛血清以及在培养液中浓度为5μg/mL的胰岛素、10ng/mL的KGF和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60％的DMEM/F12培养基。

步骤(3)中的贴壁培养条件为28℃、5％CO₂。

所述的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法，还包括大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定。

所述的大鲵特异表达基因K5、K10及P63基因的鉴定方法为：

(1)利用和大鲵同源性高的物种，针对大鲵K5、K10及P63基因，设计引物；

(2)提取大鲵皮肤表皮细胞RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，利用引物，分别进行PCR扩增；

(3)电泳检测PCR扩增产物并回收目的片段，对目的片段进行测序。

所述的引物如下：

大鲵K5基因上游引物：5’-CAGGACTCTGCTTCAACTCG-3’；下游引物：5’-CGACCAGGAGTAACATTGAAC-3’；

大鲵K10基因上游引物：5’-ACTCACCCTGTCCAAATC-3’；下游引物：5’-TCAGCCATAGCCTCATAC-3’；

大鲵P63基因上游引物：5’-TGTATTGGTGCCGTATGA-3’；下游引物：5’-GTGTTGTCCGTCACTTGC-3’。

目前，人工养殖的大鲵资源丰富，大鲵皮肤及其分泌物用于再生、创伤修复以及组织工程材料的研究前景广阔。本发明在大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养的过程中，通过不断探索，比较不同培养条件及对细胞生长、传代培养的影响，最终确定了大鲵表皮细胞的最佳培养条件：28℃、5％CO₂以及DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL的角质细胞生长因子(KGF)。本发明的培养条件公开尚属首次，这为大鲵皮肤表皮细胞的分离和人工培养开辟了新的途径，为进一步深入研究大鲵皮肤表皮细胞的功能提供了技术支持。同时，本发明在大鲵皮肤表皮细胞的鉴定过程中，寻找与大鲵相近物种的基因序列，并将不同物种基因序列进行比对，设计引物，利用RT-PCR扩增大鲵皮肤表皮特异基因K5、K10和P63基因，并对扩增结果进行序列测定，首次获得大鲵K5、K10和P63基因的序列，这对大鲵皮肤深层次研究以及利用大鲵皮肤表皮细胞进行皮肤再生、创伤修复以及构建组织工程皮肤奠定了基础。

附图说明

图1是不同温度下，组织块贴壁培养4天的情况图(100×)。图中，A是26℃条件下，B是28℃条件下，C是37℃条件下。

图2为温度28℃时，不同时间段的细胞生长情况图。图中，A为大鲵皮肤组织块图(100×)，B为组织块贴壁培养2天的情况图(200×)，C为组织块贴壁培养4天的情况图(100×)，D为组织块贴壁培养4天的情况图(200×)，E为组织块贴壁培养6天的情况图(100×)，F为组织块贴壁培养6天的情况图(200×)。

图3为传代培养过程中不同时间段的细胞情况图。图中，A是传代后培养24h(200×)，B是传代后培养6天(200×)。

图4为在不同培养液中组织块贴壁培养6天的情况图。图中，A为培养液2(200×)，B为培养液3(100×)。

图5是PCR扩增K5基因结果。其中第1泳道为内参β-actin，第2泳道为Marker 2000，第3泳道为扩增得到的K5基因片段；

图6是PCR扩增K10基因结果。其中第1泳道为Marker 2000，第2泳道为内参β-actin，第3泳道为扩增得到的K10基因片段；

图7是PCR扩增P63基因结果。其中第1泳道为内参β-actin，第2泳道为Marker 2000，第3泳道为扩增得到的P63基因片段。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1

本发明采用的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养方法，包括以下步骤：

(1)将活体大鲵固定后，从其尾部剪下1cm×1cm左右大小的皮肤组织，立即放入4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液(将PBS缓冲液用高压灭菌的超纯水稀释至PBS体积分数60％)中，10min内运至实验室超净工作台中；

(2)在超净工作台中用眼科镊将PBS中的大鲵皮肤组织表面的粘液刮除干净，放入体积分数75％酒精中浸泡10s；

(3)用4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液清洗6-8次，放入灭菌的安瓿瓶中；

(4)用眼科剪将大鲵皮肤组织剪成直径大约1mm的组织块；

(5)将组织块贴到T25培养瓶中(图2A)，加入4mL培养液，分别放入温度为26℃、28℃及37℃，5％CO₂培养箱中进行贴壁培养，每天更换新鲜培养液一次，并观察不同时间段的细胞生长情况，结果见图1A-C和图2B-F。

图1是不同温度条件下，组织块贴壁培养4天的情况。结果表明，温度为28℃时，细胞生长状态最好，优于温度为26℃时的细胞生长状态，当温度为37℃时几乎无细胞迁出。

图2B-F是温度为28℃时，不同时间段的细胞生长情况。结果表明，组织块在28℃、5％CO₂培养箱中贴壁培养2天开始有细胞迁出。贴壁培养4天，有细胞大量迁出，贴壁培养6天，细胞生长达到80％融合，可以进行传代培养。

(6)选择在28℃条件下贴壁培养6天的组织块，在培养瓶中加入0.25％胰酶进行消化，按1:3传代，观察传代后不同时间段培养的细胞生长情况(见图3A、3B)，并获得大鲵皮肤表皮细胞。

本发明实施例1方法中所述的培养液主要成分为DMEM/F12培养基，除DMEM/F12培养基外，还包括培养液总体积15％的胎牛血清以及在培养液中浓度为5μg/mL的胰岛素、10ng/mL的角质细胞生长因子(KGF)和双抗，双抗为青霉素和链霉素，其中，青霉素含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL；所述的DMEM/F12培养基是体积分数60％的DMEM/F12培养基，使用前用高压灭菌的超纯水对DMEM/F12培养基进行稀释至DMEM/F12培养基体积分数60％[培养液配方简写为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+5μg/mL胰岛素+10ng/mL KGF+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)；后续培养液简写的含义同实施例1]。

实施例2

本发明采用的大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养方法，包括以下步骤：

(1)将活体大鲵固定后，从其尾部剪下1cm×1cm左右大小的皮肤组织，立即放入4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液中，10min内运至实验室超净工作台中；

(2)在超净工作台中用眼科镊将PBS中的大鲵皮肤组织表面的粘液刮除干净，放入体积分数75％酒精中浸泡10s；

(3)用4℃预冷的、添加双抗(青霉素500U/mL、链霉素0.5mg/mL)的60％PBS缓冲液清洗6-8次，放入灭菌的安瓿瓶中；

(4)用眼科剪将大鲵皮肤组织剪成直径大约1mm的组织块；

(5)将组织块贴到T25培养瓶中，分别加入4mL培养液1、培养液2和培养液3，再放入28℃、5％CO₂培养箱中培养，每天更换相应的新鲜培养液一次，并观察不同时间段的细胞生长情况。

培养液1为实施例1的培养液。

培养液2的配方为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)。

培养液3的配方为：DMEM/F12(60％)+15％FBS+1％胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂(ITS)(100×)+双抗(青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL)。

(6)组织块贴壁培养6天后，观察细胞的生长情况，结果见图4A-B。

图4A为培养液2的细胞生长情况图。图4A结果表明，以培养液2培养的细胞，其细胞之间的连接非常松散，后续无法传代培养。

图4B为培养液3的细胞生长情况图。图4B结果表明，以培养液3培养的细胞，其细胞大量聚集在一起，不能均匀分散贴到培养瓶中，后续无法传代培养。

以上结果表明，本发明培养液1的配方明显优于培养液2和培养液3，采用培养液1对细胞进行培养，细胞生长情况良好，且能够用于后续传代培养。

实施例3

本发明利用实施例1获得的大鲵皮肤表皮细胞，对大鲵K5、K10及P63基因进行测序，包括以下步骤：

(1)引物设计

由于大鲵的K5、K10和P63基因序列尚未公布，首先选定与大鲵同源性较高的物种，再在NCBI数据库中查找这些物种的K5、K10和P63基因序列，利用BioXM软件对这些物种的K5、K10和P63基因序列进行比对，在同源性高的部位设计引物。设计的引物如下：

大鲵K5基因上游引物：5’-CAGGACTCTGCTTCAACTCG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-CGACCAGGAGTAACATTGAAC-3’(SEQ ID NO.2)；

大鲵K10基因上游引物：5’-ACTCACCCTGTCCAAATC-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-TCAGCCATAGCCTCATAC-3’(SEQ ID NO.4)；

大鲵P63基因上游引物：5’-TGTATTGGTGCCGTATGA-3’(SEQ ID NO.5)；下游引物：5’-GTGTTGTCCGTCACTTGC-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)大鲵表皮细胞RNA的提取

(a)将贴壁生长的细胞用0.25％胰酶消化分解后，并加入新鲜培养液(实施例1)中和、重悬，将重悬液加入15mL离心管中进行离心，小心将上清倒掉并按100μL中含有2×10⁶个细胞的量留少量上清。充分震荡直到细胞彻底混匀，再从中取100μL重悬液加入1.5mL EP管，备用。

(b)按照培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP430)说明书中的步骤提取大鲵皮肤表皮细胞总RNA。

(3)RNA反转录

以提取的大鲵皮肤表皮细胞RNA为模板，反转录成cDNA。

(a)取出总RNA(约500ng/μL)2μg放于PCR试管中，再分别加入dNTP(2.5mM each)1μL和0.5μg/μL OligodT 1μL。

(b)70℃加热5min，冰上放置2min。

(c)在同一管中加入2μL 10×Buffer，1μL RNase抑制剂(40U/μL)和1μL反转录酶(50U/μL)。

(d)轻轻混匀后置于42℃，60min。然后置于80℃，5min。

(4)PCR扩增

以RNA反转录得到的cDNA为模板，用设计好的引物分别进行PCR扩增。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

其中2-4步循环30次。

(5)电泳检测及目的片段回收

取PCR产物5μL点样到1％的琼脂糖凝胶板上，以5V/cm的电压电泳30min，在凝胶成像系统中进行DNA条带的检测，检测到大鲵K5(图5)、K10(图6)和P63(图7)基因的表达。

同时，将PCR反应体系扩增的产物全部上样于琼脂糖胶上用以上参数进行电泳，电泳完后在紫外灯下将目的条带处的胶切下，并按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP209)说明书中的操作步骤进行DNA回收。

(6)在金思特科技(南京)公司将回收的PCR产物进行序列测定。大鲵K5、K10和P63基因片段序列分别如下：

大鲵K5基因部分序列(451bp)：

CAGGACTCTGCTTCAACTCGGCTTCTGTCAGCGATCGCCTGATACTCAGCCTTGACCTCGGCGATGATGCTGCTCAGGTCCAAAGATCGGTTGTTGTCCATCGAGAGAACCACAGAGGTGTCGGAAACCTGTGACTGCATTTGAGCTAGTTCCGCGTCATAGAGAGCTCTGAGGAAGTTGATCTCATCAGTCAGACCATCCACTTTGCTCTCCAACTCCACTTTGTTCATGTAAGCAGCATCCACATCCTTCTTGAGCACCACAAAGTCATTCTCAGCAGCAGTGCGCTTGTTGATTTCATCTTCATACTTGTTCTTGAAATCTTCAACCATGTCCTGAATGTTCCTTAGTTCTGAATCCAGTCTATGTCTGTCATTGCCCAAGCCATCCAACTGCCTACGTAAGTTGTTAATATAAGCTTCAAACATGGGTTCAATGTTACTCCTGGTCG(SEQ ID NO.7)

大鲵K10基因部分序列(207bp)：

ACTCACCCTGTCCAAATCTGACCTGGAATCTCAGCTTGAAAGCCTTGTTGAAGAAATTGCTCTTCTTAAGAAGAACCATGAGGAGGAGGTTAAAGGAGGCCAAAAAACAACTGTTGGTGATGTCAACGTAGAAATGAATGCTGCTCCAGGAAGTGATCTGCTAAAGAAAATGAATGATATGCGAGAGCAGTATGAGGCTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)

大鲵P63基因部分序列(249bp)：

TGTATTGGTGCCGTATGAACCCCCACAGGTTGGCACAGAATTTACTACGATATTGTACAATTTCATGTGCAACAGCAGCTGCGTGGGTGGGATGAACCGCCGGCCGATCCTGATCATTGTAACACTTGAAACAAGAGACGGTCAGGTTTTGGGGCGTCGGTGTTTTGAAGCTCGTATTTGCGCTTGTCCTGGCCGTGATCGCAAAGCAGATGAGGATAGCATTCGAAAGCAGCAAGTGACGGACAACAC(SEQ ID NO.9)。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳师范学院

<120> 一种大鲵皮肤表皮细胞的分离、培养及鉴定方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggactctg cttcaactcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actcaccctg tccaaatc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcagccatag cctcatac 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtattggtg ccgtatga 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgttgtccg tcacttgc 18

<210> 7

<211> 451

<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

<400> 7

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tcggaaacct gtgactgcat ttgagctagt tccgcgtcat agagagctct gaggaagttg 180

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tcttcatact tgttcttgaa atcttcaacc atgtcctgaa tgttccttag ttctgaatcc 360

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tcaaacatgg gttcaatgtt actcctggtc g 451

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<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

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<211> 249

<212> DNA

<213> 大鲵（Andrias davidianus Blanchard）

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