本发明涉及生物细胞领域，涉及一种克隆细胞的培养方法。
背景技术：
细胞克隆是生物繁殖一种类型，无性繁殖。是一种把单个细胞从群体内分离出来单独培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。克隆能够保持亲本的绝大部分性状。生物体通过无性繁殖所生成的群体或个体称为克隆体，由动物体内一个细胞经过无性生殖过程进而发育形成的动物个体为克隆动物。克隆细胞的培养至关重要，因此需要研究一种新的方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的一种克隆细胞的培养方法。
为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：一种克隆细胞的培养方法，其特征在于，包含以下步骤：
取48份克隆细胞用ELISA试剂盒检测p27抗原，将其中p27抗原检测结果为阳性提取出来，从p27抗原检测结果为阳性的克隆细胞随机抽选6份，并且1500rpm离心5分钟，接着接于长成60％单层CEF的24孔板中，培养8d后将细胞传入含飞片的六孔板中继续培养3d，无菌取出六孔板中的飞片，用固定液固定，所述固定液为丙酮与已醇以3：2的比例混合，并且加入青霉素100ul/ml、链霉素80ul/ml进行无菌培养。
本发明的有益成果是：本发明通过科学的方法对克隆细胞进行培养，首先对样本进行抽样，采用随机抽取的方式从其中抽取p27抗原检测结果为阳性的克隆细胞，严格地指定步骤，具有科学、严谨的优点。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，能实现同样功能的产品属于等同替换和改进，均包含在本发明的保护范围之内。具体方法如下：
实施例1：体外培养的生物成分无外乎两种结构形式：其一是小块组织或称为组织块(tissue block)，一般称为外植块；其二是将生物组织分散后制成的单个细胞，一般称为分离的细胞(isolated cell)或者分散的细胞(dissociated cell)。
分散的过程通常在培养液或平衡盐溶液中进行，分散的细胞被悬浮于培养液或平衡盐溶液中。单个细胞分散存在于培养液或其它平衡盐溶液中、缓冲溶液中，就称为细胞悬液(cell suspension)。
狭义的细胞培养(cell culture)主要是指分离(散)细胞培养，广义的细胞培养的概念还包括单(个)细胞培养(single cell culture)。一种是群体培养(mass culture)，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合(confluence)后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养(clonal culture)，将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
现今，用于疫苗生产的细胞基本有3类，即原代细胞、二倍体细胞株及传代细胞系。经过几十年的研究和发展，目前我国已经拥有了可以进行大规模疫苗生产的动物原代细胞、二倍体细胞和Vero细胞等生产技术，用于生产多种人用、动物疫苗。其中二倍体细胞(如我国70年代建立的人胚肺二倍体细胞株KMB17和2BS)对多种病毒具有广泛的敏感性，用其制备病毒性疫苗可以克服使用原代细胞时在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质。Vero细胞是1962年由日本Chiba大学的Yasumura等人从成年非洲绿猴肾中分离获得的，是一种贴壁依赖性成纤维细胞，核型为2n 60，高倍体率约为1.7％，可持续地进行培养，不含任何污染因子。通常使用199培养基添加5％胎牛血清进行培养。该细胞可用于多种病毒的增殖，已被WHO批准广泛用于人用、动物用疫苗生产。
实施例2：
体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代(Passage或Subculture)。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。
(一)培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells):所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞,如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：
1、原代培养(Primary Culture)期：也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的(Heterogeneous)，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。
2、传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系(Diploid Cell Line)。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。
3、衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。
在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期)，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化(Spontaneous Transformation)。转化的标志之一是细胞可能获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy)。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite CellLine)，也称连续细胞系(Continuous Cell Line)。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体(Heteroploid)。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。
(二)组织培养细胞一代生存期所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快)。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。
所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世(Generation)或倍增〔Doubling〕不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。
以上所述仅为本发明之较佳实施例，并非用以限定本发明的权利要求保护范围。同时以上说明，对于相关技术领域的技术人员应可以理解及实施，因此其他基于本发明所揭示内容所完成的等同改变，均应包含在本权利要求书的涵盖范围内。
本发明的有益成果是：本发明通过科学的方法对克隆细胞进行培养，首先对样本进行抽样，采用随机抽取的方式从其中抽取p27抗原检测结果为阳性的克隆细胞，严格地指定步骤，具有科学、严谨的优点。