一种灰楸叶片原生质的制备方法与流程

本发明涉及一种灰楸叶片原生质体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

灰楸(Catalpa fargesii)为紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa)高大落叶乔木，是我国传统栽培的优质珍贵用材及园林观赏树种。灰楸根系发达，生长速度快，抗风、固土能力强，耐寒耐旱，材质纹理通直、坚韧致密，是优质速生用材树种。

原生质体是植物细胞去除细胞壁后的产物，可应用于远源亲本间的融合，易于导入外源基因，同时也是研究细胞膜上蛋白质(如离子通道、水孔蛋白、信号受体等)功能的良好材料，并可为细胞间的物质运输，信息交换等的研究提供技术支撑。

目前关于灰楸的研究多集中于遗传多样性评价、优良新品种培育与高效繁育技术研究等方面，有关灰楸原生质体分离和制备方面的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种灰楸叶片原生质体的制备方法，该制备方法简单高效，所得原生质体数量多，活性高。

本发明的技术方案为：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体存活率的测定。

本发明提供的制备原生质体的方法，具体包括以下步骤：

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成宽度不超过0.15mm的长条形，置于含1％-3％纤维素酶Onozuka RS和0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10的酶解液中，在摇床上黑暗条件下进行酶解；优选幼嫩叶片用刀片切成1.0mm×0.1mm的长条形；

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液500～700转/min离心3～7min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。

进一步，本发明方法还包括步骤：(4)原生质体的产量用血球计数板测定，重复3次，原生质体产量(个/g)＝酶液中原生质体的数量(个)/酶解所用叶条的质量(g)。

进一步，本发明方法还包括步骤：(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，原生质体存活率＝有活力的原生质体/原生质体总数×100％。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(1)所述的灰楸组培苗高度为6-8cm，选取从上往下第3-6片叶。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液组成：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶Onozuka RS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液配制方法为：纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10、甘露醇在溶液A中充分溶解，50℃加热10min，0.45nm滤膜过滤，静置至室温使用。溶液A的构成为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的酶解温度为25-30℃，酶解时间为6-14h，床转速为50rpm。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其步骤(2)所述的用于降解细胞壁的酶优选组合为纤维素酶Onozuka RS+离析酶Macerozyme R-10，采用国产纤维素酶+离析酶Macerozyme R-10未能获得原生质体。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，所述步骤(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，优选所述的缓冲液的配置为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，0.3-0.7M甘露醇。即酶解液中不含纤维素酶Onozuka RS+离析酶Macerozyme R-10的溶液配置。

所述的灰楸叶片原生质体的制备方法，其中步骤(5)所述的0.01％酚藏花红溶液用0.6M甘露醇配制而成。

本发明进一步提供一种用于灰楸叶片原生质体制备的酶解液，所述酶解液组成为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％-3％纤维素酶Onozuka RS，0.5％-3％离析酶Macerozyme R-10，0.3-0.7M甘露醇，余量为水。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明首次对灰楸进行原生质体的分离与纯化，将为灰楸的种质资源拓展、遗传育种、基因工程等后续研究奠定良好的物质基础。

(2)本发明通过控制纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解温度、酶解时间等因素，筛选出分离灰楸叶片原生质体最适合的条件，建立了一种简单高效的灰楸叶片原生质体制备方法。

附图说明

图1为根据实施例1得到的灰楸叶片原生质体示意图，标尺为100μm。

图2为根据实施例1得到的灰楸叶片原生质体存活率结果示意图，标尺为50μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围；在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所涉及的纤维素酶Onozuka RS、离析酶Macerozyme R-10的配比及浓度组合如下：

本发明所涉及的酶解液中甘露醇浓度如下：

0.3M，04M，0.5M，0.6M，0.7M

本发明所涉及的酶解温度如下：

25℃，28℃，30℃

本发明所涉及的酶解时间如下：

6h，8h，10h，12h，14h

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解10h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，0.5％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.29×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为90.65％。

实施例2

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度25℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解12h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，2％离析酶Macerozyme R-10，0.3M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为2.16×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为77.45％。

实施例3

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第5-6片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度30℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解8h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，3％纤维素酶Onozuka RS，1％离析酶Macerozyme R-10，0.6M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.18×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为88.81％。

实施例4

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第5-6片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解12h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，1％纤维素酶Onozuka RS，2％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为0.81×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为66.64％。

实施例5

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解6h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，1％离析酶Macerozyme R-10，0.7M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为0.55×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为48.32％。

实施例6

一种灰楸叶片原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)样品筛选：取高度为6-8cm灰楸组培苗，从上往下第3-4片的幼嫩叶片。

(2)将选取的幼嫩叶片用刀片切成1mm×0.1mm的长条形，按酶解液体积(mL):叶条质量(g)＝10:1的比例将叶条置于酶解液中，温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解14h。酶解液成分为：0.01M CaCl₂，0.02M KCl，0.02M MES，0.1％BSA，2％纤维素酶Onozuka RS，3％离析酶Macerozyme R-10，0.4M甘露醇。

(3)酶解物经300目滤网过滤，将滤液600转/min离心5min，吸去上清液，沉淀用缓冲液重悬，重复上述离心操作1次，沉淀用0.5mL缓冲液重悬，即为原生质体悬浮液。缓冲液成分为步骤(2)中不含纤维素酶Onozuka RS和离析酶Macerozyme R-10的酶解液。

(4)吸取原生质体悬浮液于血球计数板上，盖上盖玻片，置于显微镜下进行计数，重复3次，取平均值。原生质体产量为1.78×10⁶个/g。

(5)原生质体悬浮液与0.01％酚藏花红溶液1:1混合，染色5min，置于显微镜下测定原生质体的存活率，随机选取5个视野进行统计，重复3次，取平均值。原生质体存活率为74.59％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出部分改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。